三白草药材HPLC指纹图谱研究

段福先，孙冬梅，江洁怡，胥爱丽

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510405; 2.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095； 3.广东省中医药研究开发重点研究室，广东 广州 510095)

三白草来源于三白草科三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.，干燥地上部分入药。其味甘、辛，性寒，归肺、膀胱经，有利尿消肿、清热解毒的功效，用于治疗水肿、小便不利、淋沥涩痛、带下，外治疮伤肿毒、湿疹等[1]。现代研究报道，三白草药材含有挥发油、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质等成分，具有抗感染、去毒、降糖、保肝、利尿等活性[2]。三白草中木脂素类成分具有多方面药理活性，如抗感染、抗氧化等[3]，三白草黄酮类成分具有很好的抑制超氧基阴离子和羟基自由基的作用[4]。近些年国内外对三白草的研究不断加深，使其应用范围不断扩大，而且在某些方面还呈现一定的开发前景。

目前，有关三白草质量控制方面的研究多集中于三白草酮、里卡灵A等单一化学成分的质量评价[5-8]，指纹图谱的研究虽也有相关报道[9]，但不够完善。为进一步完善三白草的质量控制标准，本试验采用HPLC法建立了三白草的指纹图谱，对15批不同产地的三白草样品进行分析评价，指认了13个化学成分，所建立的HPLC指纹图谱能够较全面地反映三白草药材的成分特征。并采用聚类分析进行模式识别，深入分析影响三白草质量的化学峰，能够较全面的反映三白草药材的质量。

1 仪器、材料与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、PAD检测器(美国安捷伦公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TLE204电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；ALB-200型高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)。

金丝桃苷对照品(批号：111521-201205，质量分数：98%)、芦丁对照品(批号：100080-201409，质量分数：99.8%)、槲皮苷对照品(批号：111538-200504，质量分数：98.5%)购自中国食品药品检定研究院；马兜铃内酰胺AⅡ(质量分数：93.5%)、1′-表-三白草酮(质量分数：85.3%)、(-)-三白草醇甲基醚(质量分数：97.6%)、三白草酮(质量分数：99.5%)、三白草醇(质量分数：93.3%)、saurucinolⅠ(质量分数：92.0%)、里卡灵A(质量分数：99.1%)、4-O-去甲基马纳萨亭B(质量分数：98.5%)、马纳萨亭B(质量分数：95.2%)、里卡灵B(质量分数：99.8%)为中山大学徐俊教授团队提供，从三白草药材中分离鉴定；甲醇为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

15批三白草批号及产地来源见表1，经广东省中医药工程技术研究院刘法锦教授鉴定为三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.的干燥地上部分。

表115批三白草样品信息表

Table1Sources of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill

编号产地 收集日期编号产地 收集日期S1湖北2016-12S9安徽2016-12S2湖北2016-12S10广西2016-12S3湖北2016-12S11广西2016-12S4四川2016-12S12湖北2016-07S5河北2016-12S13云南2016-12S6河北2016-12S14云南2016-12S7浙江2016-12S15湖北2016-11S8浙江2016-12

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters XbridgeTMC18色谱柱 (4. 6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～21 min，14%A；21～37 min，14%A→39%A；37～42 min，40%A→52%A；42～96 min，52%A→80%A；96～105 min，80%A→95%A)；柱温为25 ℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为238 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取适量芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、马兜铃内酰胺AⅡ、1′-表-三白草酮、saurucinolⅠ、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇、里卡灵A、4-O-去甲基马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B，加入10 mL容量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为芦丁21.54 μg/mL、金丝桃苷35.46 μg/mL、槲皮苷41.36 μg/mL、马兜铃内酰胺AⅡ 45.67 μg/mL、1′-表-三白草酮49.28 μg/mL、(-)-三白草醇甲基醚67.58 μg/mL、三白草酮179.04 μg/mL、三白草醇52.80 μg/mL、saurucinolⅠ26.27 μg/mL、里卡灵A 80.67 μg/mL、4-O-去甲基马纳萨亭B 80.48 μg/mL、里卡灵B 67.04 μg/mL、马纳萨亭B 122.08 μg/mL的混合对照品甲醇溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取三白草样品粉末(过4号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%(体积分数，下同)甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，经过0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取S1供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下方法测定。以3号峰槲皮苷为参照峰，计算得1～20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<3%，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0.990，表明仪器稳定，精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批三白草样品(S1)，共6份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，按“2.1”项下方法测定。以3号峰槲皮苷为参照峰，计算得1～20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<3%，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0.990，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取S1供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、18、24 h进样，按“2.1”项下方法测定。以3号峰槲皮苷为参照峰，计算得1～20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<3%，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0.990，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 三白草样品对照指纹图谱的建立与分析评价

2.4.1 三白草样品图谱采集和对照指纹图谱的建立 将15批三白草药材按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样检测并记录各批次的色谱图，得到15批药材的叠加指纹图谱，见图1。将所得三白草HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”，将样品S1的图谱设为参照图谱，选择中位数法生成对照指纹图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，对15批药材的指纹图谱进行多点校正后进行峰匹配，生成三白草药材指纹图谱的共有模式并标定20个共有峰，共有模式指纹图谱见图2。

S1～S15.表1中S1～S15；R.共有模式指纹图谱

图115批三白草药材HPLC指纹图谱叠加图

Figure1HPLC fingerprints of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

1.芦丁； 2.金丝桃苷； 3.槲皮苷； 6.马兜铃内酰胺AⅡ； 10. 1′-表-三白草酮； 13.(-)-三白草醇甲基醚； 14.三白草酮； 15.三白草醇； 16.saurucinolⅠ; 17.里卡灵A； 18. 4-O-去甲基马纳萨亭B； 19.里卡灵B； 20.马纳萨亭B。

图2三白草药材共有模式指纹图谱(A)和混合对照品溶液指纹图谱(B)

Figure2HPLC fingerprints of common model (A) and mixed reference solution (B) ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

2.4.2 指标性成分的指认 按“2. 2”项下方法配置对照品溶液进行分析测定，其中3号峰槲皮苷峰面积适中、保留时间适宜，故选为参照峰S。以3号峰为参照峰，确定了20个共有峰为特征峰。将混合对照品溶液以相同条件进样测定，与共有模式图谱进行比较，根据保留时间，结合紫外全波长扫描图，指认出图谱中13个色谱峰，分别为芦丁(1号峰)、金丝桃苷(2号峰)、槲皮苷(3号峰)、马兜铃内酰胺AⅡ(6号峰)、1′ -表-三白草酮(10号峰)、 (-)-三白草醇甲基醚(13号峰)、三白草酮(14号峰)、三白草醇(15号峰)、saurucinolⅠ(16号峰)、里卡灵A(17号峰)、4-O-去甲基马纳萨亭B(18号峰)、里卡灵B(19号峰)、马纳萨亭B(20号峰)，共有峰相对保留时间与峰面积见表2～表3。

表2 15批三白草药材相对保留时间Table 2 Relative retention time of common peaks of 15 batches of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

表3 15批三白草药材相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peaks of 15 batches of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

2.4.3 指纹图谱的相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”软件，对15批三白草药材的指纹图谱进行相似度评价和数据匹配。以生成的共有模式图谱作为对照，各15批药材图谱相似度均大于0.9，表明15批三白草药材的成分稳定，结果见表4。

表415批三白草药材的相似度

Table4The similarity of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

编号相似度编号相似度S10.974S90.964S20.908S100.943S30.955S110.972S40.953S120.971S50.990S130.964S60.990S140.987S70.990S150.959S80.982

2.4.4 系统聚类分析 将15批三白草样品的HPLC指纹图谱中20个共有峰的峰面积导入SPSS22.1统计分析软件，采用组间联接法，以欧式平方距离对样品进行聚类分析，结果见图3。第一类为S3、S4、S5、S6、S9、S12、S14、S15，各个批次的样品相似度较高(0.953～0.990)；第二类为S2、S10，各个批次相似度较低(0.908～0.943)；第三类为S1、S7、S8、S11、S13，各个批次的样品相似度最为接近(0.964～0.990)。这与指纹图谱的相似度分析结果基本一致。

图315批三白草药材的系统聚类分析结果

Figure3Dendrogram of clustering analysis of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

3 讨论

本试验考察了超声、回流2种提取方法提取效果，结果表明回流所得各色谱峰面积较大，峰型较好、峰高较高，故选择回流提取作为提取方法。采用甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸等不同洗脱系统进行比较和考察。结果表明，用甲醇-水洗脱，所得图谱中峰信息较多、峰型较好、分离度佳，故选择甲醇-水作为洗脱流动相。实验同时考察了5个不同波长下的吸收图谱，包括238、256、280、320和360 nm。相较之下，在238 nm波长下所得的色谱图峰信息较多、峰型较好，基线相对较平稳，故选择238 nm为检测波长。

本研究采用HPLC-PDA法建立了三白草药材的指纹图谱，以3号峰为参照，确定了20个共有峰为特征峰，并且指认了指纹图谱中13种已知成分，其中1号峰为芦丁、2号峰为金丝桃苷、3号峰为槲皮苷、6号峰为马兜铃内酰胺AⅡ、10号峰为1′ -表-三白草酮、13号峰为(-)-三白草醇甲基醚、14号峰为三白草酮、15号峰为三白草醇、16号峰为saurucinolⅠ、17号峰为里卡灵A、18号峰为4-O-去甲基马纳萨亭B、19号峰为里卡灵B、20号峰为马纳萨亭B。三白草指纹图谱中共有峰的保留时间差别较小，但峰面积差异较大，说明不同产地的同一化学成分的量有差别。采用相似度评价软件对不同产地的药材进行比较分析，得出15批三白草药材指纹图谱与共有模式比较相似度为0.908～0.990，除S2、S10号样品外，其余13批不同产地的三白草样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.95，表明不同产地的三白草质量相对稳定。