HPLC法同时测定不同生长年限不同部位杜仲中5 种苯丙素类成分

张子东，付冬梅，张威鹏，张 琳,*，祖元刚

（1.东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学

教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为杜仲科杜仲属植物，现已收入我国药食同源管理系统，已被世界许多国家引用栽培，供保健、药用和观赏[1]。《神农本草经》《本草纲目》《本草经集注》等典籍中就记载了杜仲的保健功能。传统上以杜仲皮为保健原料，由于当杜仲的生长年限到达20 a左右，其杜仲皮才更具有保健功效[2]，而杜仲剥皮会导致树木死亡[3]，严重破坏我国二级保护植物杜仲资源。为解决当前杜仲树皮资源问题，急需探索杜仲其他药用部位中的相似活性成分。近期报道发现，杜仲叶中富含的苯丙素类成分具有广泛的降压、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、强筋健骨、增加胃肠蠕动和促进胃液分泌的药理作用[4-6]。目前针对杜仲中木脂素类、黄酮类活性成分的检测分析方法较多[7-11]，而针对杜仲中苯丙素类成分的研究相对较少[12]。苯丙素作为杜仲中主要活性成分，不同药用部位含量不同，具有一定的开发价值[13-14]。有研究报道称杜仲叶中的绿原酸含量远高于杜仲干皮[15-16]，但鲜见对不同生长年限的杜仲叶、干皮中一系列苯丙素类成分的含量进行比较研究。因此，本实验建立同时测定杜仲中的绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 种苯丙素类活性成分的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，分别测定树龄为16、18、20、22、24 a的杜仲叶与杜仲干皮2 种部位中绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 种苯丙素类成分含量，为药食同源植物的质量控制指标提供依据，并为其开发研究提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生长年限分别为16、18、20、22、24 a的杜仲叶、杜仲干皮样品来自陕西省汉中市略阳县国家杜仲良种基地。

标准品：紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸（纯度＞98%）中国药品生物制品检定所；原儿茶酸（纯度＞98%）大连美仑生物技术有限公司；松柏苷（纯度≥98%）上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；实验用水为去离子水；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A HPLC仪（包括SPD-20A紫外检测器）日本岛津公司；KQ2200D型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DFT-50手提式高速万能粉碎机温岭市林大机械有限公司；Unique-LC R20多功能超纯水系统 厦门锐思捷水纯化技术有限公司；D3024R高速冷冻离心机 大龙兴创实验仪器有限公司；BS124S型分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声辅助法提取苯丙素类成分的单因素试验

因绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 种苯丙素类活性成分极性较大，通常可选择甲醇、乙醇或水进行提取，为将苯丙素类成分提取全面，选择极性相对较大的甲醇作为提取溶剂。分别对甲醇体积分数、超声提取时间、料液比进行单因素试验，考察各因素对杜仲中苯丙素类成分含量提取率的影响[17-19]。

1.3.1.1 甲醇体积分数对杜仲样品中苯丙素类成分提取率的影响

分别精密称取4 份杜仲样品20 g，分别加入体积分数25%、50%、75%、100%甲醇溶液，料液比为1∶10（g/mL），超声提取30 min，以杜仲中苯丙素类成分提取率之和为考察指标，考察甲醇体积分数对杜仲中苯丙素类成分提取率的影响。

1.3.1.2 超声提取时间对杜仲样品中苯丙素类成分提取率的影响

分别精密称取4 份杜仲样品20 g，加入体积分数100%甲醇溶液，料液比为1∶10（g/mL），超声提取15、30、45、60 min，以杜仲中苯丙素类成分提取率之和为考察指标，考察超声提取时间对杜仲中苯丙素类成分提取率的影响。

1.3.1.3 料液比对杜仲样品中苯丙素类成分提取率的影响

分别精密称取4 份杜仲样品20 g，加入体积分数100%甲醇溶液，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL），超声提取30 min，以杜仲中苯丙素类成分提取率之和为考察指标，考察料液比对杜仲中苯丙素类成分提取率的影响。

1.3.2 苯丙素类成分HPLC测定

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：HiQ Sil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～12 min，4%～12% B；12～35 min，12%～14% B；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长277 nm；进样量5 μL。

1.3.2.2 混合标准品溶液的制备

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷标准品适量，用无水甲醇溶解，配制成1 mg/mL的混合标准品溶液。

1.3.2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取粉碎后的杜仲叶、杜仲干皮粉末1.0 g，加入10 mL无水甲醇超声提取30 min，过滤，保留滤液。滤渣再次加入10 mL无水甲醇超声提取30 min，过滤，合并滤液，混匀。分别从各合并滤液中吸取1 mL，12 000 r/min离心10 min，取上清液即得。

1.3.2.4 方法学考察

1.4 统计分析

用R studio软件Tidyverse包，对所得数据进行可视化处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 测定成分选择结果

苯丙素类是广泛存在于药用植物中的天然产物，具有非常丰富的生理活性，尤其具有降压、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理活性[22]。杜仲中苯丙素类成分功能已经成为天然降压、抗炎保健食品的重要来源[23]，现已成为众多植物学家，药物化学家的重点研究对象。绿原酸、咖啡酸、松柏苷、原儿茶酸、紫丁香苷为杜仲中苯丙素类代表性成分，并且这5 种成分也是其他某些药用植物的质量控制标准。其中绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸的降压、抗菌抗炎活性机制已有大量研究报道[24-28]。因此本实验选择以上5种苯丙素类成分为测量指标，研究不同生长年限杜仲叶、杜仲干皮中苯丙素类成分含量，为杜仲的开发研究提供一定的参考价值。根据大部分研究报道可知，建立测定杜仲中绿原酸含量的HPLC方法相对较多，针对性建立测量杜仲中一系列苯丙素类成分的HPLC方法却很罕见，本实验的检测方法对于富含这5 种苯丙素类成分的天然药物质量评价、含量分析具有一定的参考价值。

线性关系：取1.3.2.2节原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸的混合标准品溶液，精密梯度稀释成质量浓度分别为1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 mg/mL的含有5 种苯丙素类成分的混合标准品溶液，在1.3.2.1节色谱条件下进样，进样量为5 µL，以标准品质量浓度X（mg/mL）为横坐标，色谱峰峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度：将1.3.2.2节混合标准品溶液梯度稀释成低、中、高3 种不同质量浓度（0.01、0.1、1 mg/mL）的供试品溶液，并连续进样5 次，每次5 μL，按1.3.2.1节HPLC条件测定峰面积，分别计算各成分峰面积的相对标准偏差。

稳定性：取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样5 µL，按1.3.2.1节HPLC条件测定峰面积，分别计算各成分峰面积的相对标准偏差。

重复性：分别称取杜仲叶、干皮粉末各5 份，按1.3.2.3节方法制备供试品溶液（n=3），按1.3.2.1节HPLC条件测定峰面积，计算各成分峰面积相对标准偏差。

加标回收率：称取已知含量的杜仲叶粉末适量，共6 份，按1.3.2.3节方法平行制备供试品溶液，精密称取10 mL供试品溶液，分别适量加入1.3.2.2节混合标准品溶液，按1.3.2.1节HPLC条件进样测定，计算原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸的加标回收率与相对标准偏差[20-21]。

1.3.2.5 样品测定

将经过1.3.2.3节方法处理的各供试品溶液应用1.3.2.1节色谱条件进行HPLC测定，进样量为5 μL，应用外标法测定含量。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 甲醇体积分数的影响

图 1 甲醇体积分数对苯丙素类成分提取率的影响Fig. 1 Effect of MeOH concentration on the yield of phenylpropanoids

由图1可知，甲醇体积分数对杜仲中苯丙素类成分提取率影响较大，随甲醇体积分数的增加，苯丙素类成分提取率随之增加，且在甲醇体积分数为100%时，苯丙素类成分提取率最大。所以选择100%甲醇溶液作为提取溶液。

2.2.2 超声提取时间的影响

由图2可知，超声提取时间对杜仲中苯丙素类成分提取率影响较大，随超声提取时间的延长，苯丙素类成分提取率随之增加，且在超声提取时间为30 min时，苯丙素类成分提取率最大，可得最佳超声提取时间为30 min。

图 2 超声提取时间对苯丙素类成分提取率的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of phenylpropanoids

2.2.3 料液比的影响

图 3 料液比对苯丙素类成分提取率的影响Fig. 3 Effect of solid to solvent ratio on the yield of phenylpropanoids

由图3可知，随着溶剂量的增加，苯丙素类成分提取率呈增加趋势。当料液比为1∶10（g/mL）时，提取率达到最大值，当溶剂量继续增加时提取率呈下降趋势，可得最佳料液比为1∶10（g/mL）。

2.3 苯丙素类成分HPLC测定

2.3.1 色谱条件选择结果

本实验通过借鉴测定杜仲中绿原酸含量HPLC方法[29-30]，建立1.3.2.1节色谱条件。实验过程中发现选择甲醇为流动相时，5 种成分的色谱峰出现堆积现象，于是选择极性更大的乙腈作为流动相。在流动相A的选择上，实验初期存在峰后拖现象，于是将流动相A在0.1%甲酸的基础上改为0.2%甲酸后，峰拖尾现象明显改善。实验结果表明，在最终HPLC条件下各色谱峰分离效果最佳。

2.3.2 HPLC分析

如图4所示，杜仲叶、干皮样品中5 种苯丙素成分分离度良好，基线平稳，出峰完全且峰形规范。

图 4 混合标准品（A）、杜仲叶样品（B）、杜仲干皮样品（C）的HPLC图Fig. 4 HPLC chromatograms of standard mixture (A), E. ulmoides Oliv. leaves (B), and barks (C)

2.3.3 方法学考察结果

2.3.3.1 线性关系

由表1可知，各苯丙素类成分在各自线性范围内线性关系良好。

表 1 5 种成分的线性关系Table 1 Linear relationships of five phenylpropanoids

2.3.3.2 精密度

结果显示，低质量浓度组中绿原酸、松柏苷、原儿茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面积相对标准偏差分别为0.89%、1.43%、2.87%、2.09%、4.15%；中质量浓度组中绿原酸、松柏苷、原儿茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面积相对标准偏差分别为1.76%、2.88%、1.09%、3.25%、2.87%；高质量浓度组中绿原酸、松柏苷、原儿茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面积相对标准偏差分别为4.31%、0.98%、2.87%、1.23%、3.28%，表明分析方法的精密度良好。

2.3.3.3 稳定性

结果显示绿原酸、松柏苷、原儿茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面积相对标准偏差分别为0.78%、1.55%、0.99%、2.35%、0.98%，说明样品在24 h内稳定。

2.3.3.4 重复性

结果显示，原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸峰面积相对标准偏差分别为0.53%、0.97%、1.12%、1.44%、0.67%。表明该方法重复性较好。

2.3.3.5 加标回收率

根据1.3.2.4节方法学考察中加标回收率考察方法，计算原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸的加标回收率与相对标准偏差，结果如表2所示，此方法具有较好的检测性能。

表 2 回收率实验结果Table 2 Results of recovery tests

2.4 杜仲中苯丙素类成分含量测定结果

取树龄为16、18、20、22、24 a的杜仲叶、杜仲干皮样品，按1.3.2.3节方法分别制备供试品溶液，后采用1.3.2.1节HPLC条件进行测定（n=3），取平均值后，根据2.3.3.1节各成分的标准曲线计算5 种苯丙素类成分的含量，如表3所示。

表 3 不同生长年限杜仲叶、干皮5 种苯丙素类成分测定结果Table 3 Contents of 5 phenylpropanoids in E. ulmoides Oliv. leaves and barks in various growing yearsμg/g

为使各样品中5 种苯丙素类成分含量数据更便于比较，使用R语言Tidyverse包将表3中数据进行可视化处理。由于不同药用部位杜仲样品中的苯丙素类成分含量差距巨大，于是将所有含量结果进行取对数（lg）运算，如图5所示。

图 5 杜仲样品中5 种苯丙素类活性成分含量的环状柱形图Fig. 5 Circular barplot of contents of 5 phenyl compounds in E. ulmoides Oliv. samples

研究表明，杜仲叶、干皮中均含有这5 种苯丙素类化合物，但其含有量差别较大。由图5可知，绿原酸在杜仲叶与杜仲干皮中含量差异尤为明显（P＜0.01），杜仲叶中的绿原酸含量平均约为杜仲干皮中的57 倍；杜仲叶中松柏苷、紫丁香苷含量约为杜仲干皮的1.24、9.19 倍；咖啡酸、原儿茶酸在杜仲叶、干皮中含量均较低，且含量差距不大，咖啡酸在杜仲叶中含量约为干皮的2.4 倍，而杜仲干皮中的原儿茶酸含量大部分要高于杜仲叶。杜仲叶中的多数苯丙素类成分含量存在远高于杜仲干皮的现象。因为各生长年限的杜仲叶、杜仲干皮中均含有这5 类具有降压、抗炎作用的苯丙素类活性成分，且杜仲叶中的5 种苯丙素类活性成分总量高于杜仲干皮，所以在抗炎杀菌、降压药物使用上，可以考虑使用杜仲叶代替杜仲干皮。

3 结 论

以HPLC法同时测定杜仲中绿源酸、咖啡酸、原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 种苯丙素类成分含量，建立HPLC含量测定方法，此分析方法精密度、稳定性、重复性好，可作为杜仲中5 种苯丙素类成分的检测方法，为杜仲的综合利用和深度开发提供质量控制参考依据。由于各生长年限的杜仲叶与杜仲干皮中均含有这5 类活性成分，且杜仲叶与杜仲干皮中的成分含量存在明显不同，这在将杜仲应用于抗炎杀菌、降压、强筋健骨保健品的开发上应当注意。因为杜仲叶中苯丙素类成分含量较高，且杜仲叶为可再生资源，所以可进一步考虑有关杜仲叶的研究与开发。