新型抗肝癌化合物CBI-5725对RAF/MEK/ERK通路及癌细胞凋亡的影响

王 威，徐 波，闫素英*

0 引言

肝细胞癌(HCC)被认为是世界第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因[1]。并且，由于肝癌是由慢性肝病引起的，经常在晚期时才被诊断出来，因此,药物是晚期肝癌患者治疗的主要手段之一。化疗药物如多柔比星是目前用于治疗肝癌的主要药物;然而，这些具细胞毒性的药物是非选择性的，并能引起严重的毒副作用[2]。因此，研究人员开始研究靶向治疗药物。索拉非尼(Sorafenib)是唯一获得批准的适用于HCC患者的一线靶向药物[2]。其通过抑制RAF激酶(突变体、野生型的B-RAF和C-RAF)，阻碍RAF/MEK/ERK信号通路，从而抑制肿瘤增殖[3]。此外，索拉非尼强烈抑制促进血管生成的酪氨酸激酶受体(Receptor tyrosine kinase,RTK)，如血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、血管内皮生长因子受体3(VEGFR 3)、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、Flt3和c-Kit[4]。除了阻断RAF/MEK/ERK通路外，索拉非尼还能诱导肝癌细胞PLC/PRF/5的凋亡，与caspase的活化无关[3]。尽管索拉非尼是可以延长晚期HCC患者总生存时间的唯一可用的治疗药物，但随之而来的耐药性通常阻碍其长期疗效[5]。随着索拉非尼的出现，研究者已经对一系列药物(主要是分子靶向药物)进行了临床研究，然而，除了瑞格非尼(Regorafenib)、乐伐替尼(Lenvatinib)外，其他药物试验均以失败告终[6]。CBI-5725是一种新型双芳基脲，中美冠科生物技术有限公司(Crown Bioscience Inc.China)拥有其专利。本研究，评估了该化合物的体外和体内的抗肝癌作用，探讨了CBI-5725的抗肝癌机制。

1 材料

1.1 仪器 酶标仪/分光光度计(德国Fluostar Optima BMG公司)；成像分析系统(美国UVP公司)；倒置显微镜(日本YMPUS IMT-2公司)；60 mm×15 mm组织培养皿(美国Nunclon)；凝胶电泳仪、湿式转膜仪(美国Bio-Rad公司)；EC3成像系统(美国UVP)；普通离心机(德国Hettish Rotofix32公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 化合物与试剂 索拉非尼购自Selleck (中国，上海蓝木)，CBI-5725由中美冠科生物技术有限公司(Crown Bioscience Inc.China)合成。见图1。化合物均溶解在100%的DMSO(德国AppliChem公司)中，并用含10%胎牛血清(奥地利PAA公司)的培养基MEM[中国迈晨科技(北京)有限公司]稀释成不同浓度，并使DMSO最终浓度为0.1%。用DMSO作为溶剂对照处理细胞，最终浓度为0.1%(v/v)。AlamarBlue试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司，0.1 mmol/L钒酸盐购自美国Santa Cruz公司，蛋白酶抑制剂混合片剂购自瑞士Roche公司，RIPA裂解缓冲液购自美国Applgene公司，牛血清白蛋白(BSA)购自美国Amresco公司，磷酸化B-RAF(pB-RAF)、磷酸化C-RAF(pC-RAF)、磷酸化MEK(p-MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)、相应的非磷酸化蛋白、GAPDH、caspase-3和PARP抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗购自美国Santa Cruz公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海生工Sangon Biotech公司。

图1 CBI-5725化学结构式

1.3 细胞 人肝癌细胞系PLC/PRF/5购自中国食品药品检定研究院。

2 方法

2.1 细胞培养 PLC/PRF/5细胞培养于MEM培养液,临用时加入10%的胎牛血清，然后置于37 ℃ 温箱，5%CO2孵箱中培养。

2.2 AlarmaBlue检测化合物对细胞增殖的影响 取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化液消化制成单细胞悬液，以最佳浓度5×104/ml 接种于无菌96孔培养板中，100 μl/孔，各实验组均设置3个复孔。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育24 h。弃掉原培养液，用PBS清洗一遍，再加入按3倍倍比稀释成不同浓度(0、0.007 6、0.022 9、0.068 6、0.205 8、0.617 3、1.85、5.55、16.7、50 μmol/L)的索拉非尼或CBI-5725各100 μl,并使DMSO最终浓度为0.1%，溶剂对照组加入0.1%(v/v)的DMSO。每一浓度均设3个重复孔，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中继续培养72 h,每孔加入AlarmaBlue 10 μl,继续培养1～4 h。用多功能酶标仪在595 nm波长处测定每孔的荧光强度值。绘制荧光强度值与药物浓度之间的曲线，计算IC50。

2.3 Western blot法检测细胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK1/2、caspase-3、PARP、Akt蛋白表达 取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化液消化制成单细胞悬液，以6×105个细胞/皿的密度接种于60 mm×15 mm组织培养皿中。置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育24 h。之后，将细胞用无血清培养基洗涤一次，并用不同浓度的索拉非尼或CBI-5725处理2 h。用含有0.1 mmol/L钒酸盐的预冷PBS洗涤细胞以抑制脱磷酸化，然后用含有蛋白酶抑制剂混合片剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。离心裂解物后，将90 μg可溶性蛋白质经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。采用半干式电转印法将蛋白转入聚偏氟乙烯膜，在10%牛血清白蛋白(BSA)(磷酸化蛋白质)或10%脱脂奶室温封闭转印1 h，放入杂交袋中，加入一抗稀释液(1∶1 000)，封口，4 ℃孵育过夜，随后洗膜3次，每次10 min；加入HRP标记的二抗，室温放置1 h后洗膜3次，每次10 min。用增强化学发光法处理膜，并通过EC3成像系统检测蛋白质信号。用Image-Pro Plus Version 6.0软件进行分析，试验重复3次。

2.4 Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测化合物对细胞凋亡的影响 取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化液消化制成单细胞悬液，以2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育24 h。用不同浓度的化合物处理细胞24 h 或48 h，细胞凋亡刺激完毕后，离心，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后重悬于500 μl结合缓冲液中。 向细胞中加入5 μl的Annexin V-FITC，并在室温下温育10 min。 随后，加入5 μl碘化丙啶(PI)，将细胞避光孵育10 min，随即进行流式细胞仪检测。

2.5 小鼠肿瘤模型实验 雄性NCr-nu/nu小鼠，5周龄，购自Vital River(中国北京)公司。小鼠被安置并随意接受水和食物。根据宣武医院动物伦理委员会批准的方案进行使用这些小鼠的实验。取对数生长期的PLC/PRF/5细胞，用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen，USA)消化制成单细胞悬液。PLC/PRF/5细胞(5×106)悬浮于含50%基质胶(BD Biosciences，USA)的无血清培养基中，被注射入每只老鼠的背侧。甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)和CBI-5725溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)/95%乙醇(50∶50; Sigma-Aldrich，USA)中。当PLC/PRF/5肿瘤达到200～220 mm3时，口服给药，每日1次，持续14 d，剂量为甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)8 mg/kg或20 mg/kg，CBI-5725 2 mg/kg或6 mg/kg或15 mg/kg。使用游标卡尺测量肿瘤，通过测量最长(a)和最短(b)直径来确定肿瘤体积，并使用公式a×b2×π/6来计算肿瘤体积。

3 结果

3.1 CBI-5725对细胞增殖的影响 在本研究中，采用AlamarBlue测定索拉非尼或CBI-5725对人肝癌PLC/PRF/5细胞系增殖的抑制作用。不同浓度索拉非尼或CBI-5725对PLC/PRF/5细胞增殖的影响见图2。结果显示，两种药物均能明显抑制细胞的生长，并且，随着剂量的增加，抑制作用逐渐增强，具有浓度依赖性。在本研究中，CBI-5725作用于PLC/PRF/5细胞系的IC50是(0.83±0.09)μmol/L，索拉非尼作用于PLC/PRF/5细胞系的IC50是(4.99±0.13)μmol/L，CBI-5725对PLC/PRF/5细胞的抑制效果高于索拉非尼，且差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 CBI-5725或索拉非尼对PLC/PRF/5细胞的抑制作用

3.2 CBI-5725对细胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表达的影响 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是调节正常细胞增殖、存活和分化的关键信号蛋白[7]。 MAPK通路通过三级激酶级联的形式传导细胞外信号，即从RAF激酶→MEK激酶→ERK激酶发起的级联磷酸化过程[8]。MAPK信号通路的失调在肝细胞癌(HCC)发生和发展中起重要作用[9]。蛋白表达图见图3，测定结果见图4。每个磷酸化蛋白与内参蛋白的比例通过单因素方差分析(ANOVA)进行检验，然后进行Tukey事后检验。如图3所示，在2 h 作用时间下，与对照组相比，索拉非尼或CBI-5725对pB-RAF的表达均没有影响，但均能使pC-RAF表达水平随着化合物浓度的增加而显著增加。虽然CBI-5725和索拉非尼都增强了C-RAF的磷酸化，但两者都以剂量依赖性方式抑制MEK和ERK的磷酸化，表明CBI-5725和索拉非尼都是泛RAF激酶抑制剂。

无论是CBI-5725还是索拉非尼,都没有影响总的RAF、MEK、ERK和Akt表达，而且Akt的磷酸化也没有发生变化。图4显示，CBI-5725和索拉非尼对RAF/MEK/ERK信号通路的抑制作用比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 CBI-5725对PLC/PRF/5细胞凋亡的影响 为了确定细胞周期停滞表型是否与凋亡诱导相关，采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色[10]。总的凋亡细胞比例是早期凋亡和晚期凋亡细胞占所有细胞百分比的总和[11]。如图5所示，24 h、48 h后，各处理组细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01)。CBI-5725 5、15 μmol/L处理细胞48 h后，细胞凋亡率均高于处理24 h时，且15 μmol/L组高于5 μmol/L组(P<0.01)，表明CBI-5725呈浓度依赖性发诱导细胞凋亡；处理24 h、48 h后，CBI-5725 15 μmol/L组细胞凋亡率高于索拉非尼15 μmol/L组(P<0.01)。

图3 PLC/PRF/5各组细胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt、GAPDH蛋白的表达

图4 PLC/PRF/5细胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表达的光密度分析

图5 PLC/PRF/5细胞中CBI-5725或索拉非尼介导的细胞凋亡

注：与对照组比较，* *P<0.01; 与CBI-5725 15 μmol/L比较，##P<0.01

3.4 CBI-5725对细胞中caspase-3前体、PARP及切割后的PARP片段的表达的影响 蛋白表达及测定结果见图6， 对目的蛋白灰度值与内参 GAP-DH灰度值的比值进行单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey事后检验。如图6所示，用CBI-5725处理细胞48 h后，caspase-3前体和PARP的表达水平呈浓度依赖性的减低，切割后的PARP片段表达水平呈浓度依赖性的升高。然而，在用索拉非尼处理的细胞中，caspase-3前体、PARP及切割后的PARP片段的表达水平无显著差异(P>0.05)。CBI-5725 15 μmol/L组caspase-3前体和PARP的水平远低于对照组细胞(P<0.01)，但切割后的PARP片段表达水平高于对照组(P<0.01)。然而，索拉非尼15 μmol/L组上述指标与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。这与Annexin V-FITC/PI双染检测到的细胞凋亡结果一致。结果表明，CBI-5725能更好地引起caspase-3介导的细胞凋亡，这可能是本品能更有效地诱导细胞凋亡的原因。

3.5 CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠肿瘤模型的肿瘤生长 为了验证CBI-5725对PLC/PRF/5细胞的作用是否具有临床相关性，我们用HCC小鼠肿瘤模型以评估并比较CBI-5725与索拉非尼的体内效应。在实验中使用的每只小鼠中均观察到单个肿瘤，每个治疗组相对于对照组体重没有增加。如图7B所示，CBI-5725显著抑制PLC/PRF/5肿瘤生长。对照组的最大肿瘤直径为21 mm，2 mg/kg CBI-5725在治疗结束时抑制约73%的肿瘤生长(最大肿瘤直径为13.4 mm)，6、18 mg/kg CBI-5725分别抑制89%、92%的肿瘤生长(最大肿瘤直径分别为10.7、10.3 mm)。另一方面，图6A显示，甲苯磺酸索拉非尼以剂量依赖性方式抑制PLC/PRF/5肿瘤生长。在剂量为10、20 mg/kg时，索拉非尼分别抑制19%和64%的肿瘤生长(最大肿瘤直径分别为19.5、15 mm)。

图6 PLC/PRF/5各组细胞中Caspase-3前体、PARP及切割后的PARP片段的表达(*P<0.05，**P<0.01)

4 讨论

索拉非尼是一种多激酶抑制剂，是唯一批准用于HCC患者的一线靶向药物。然而，HCC中索拉非尼耐药性的增加降低了其疗效[12]。最近研究表明，多激酶抑制剂乐伐替尼和瑞格非尼分别到达了一线和二线治疗的主要终点，其中瑞格非尼是目前唯一被FDA批准的治疗HCC的二线药物。3种药物的作用靶点、生存期、不良反应等见表1[13]。

本研究中，与索拉非尼相比，CBI-5725更有效地阻止了人类HCC细胞系的增殖并诱导细胞凋亡。 CBI-5725阻断RAF/MEK/ERK通路，并诱导依赖于caspase-3/PARP活化的细胞凋亡。 此外，CBI-5725通过抑制PLC/PRF/5小鼠肿瘤模型的肿瘤生长发挥了强大的抗肿瘤活性。 因此，CBI-5725是替代索拉非尼治疗HCC的潜在治疗选择。

图7 CBI-5725(B)或sorafenib(A)对PLC/PRF/5小鼠肿瘤模型的作用(***P<0.001)

RAF激酶是MEK/ERK激酶的重要调节者，RAF/MEK/ERK的信号级联调节正常细胞增殖和存活所需要的多种生理功能。然而，该信号通路的过度激活诱导了人类肿瘤中异常的细胞生长。RAF/MEK/ERK通路的信号传导上调在肝癌的发生发展中有重要作用[3]。RAF激酶活性与癌症密切相关，在过去的十年中已经开发了多种ATP竞争性的RAF激酶抑制剂[14]。 当上游的RAS发生致癌突变时，选择性B-RAF激酶抑制剂，如维罗非尼(Vemurafenib)和达拉非尼(Dabrafenib),与RAF异二聚体(C-RAF/B-RAF)中的一员结合，这样的结合抑制了二聚体中的一员，但是反式激活了无药物结合的另一员[15],因此，选择性B-RAF抑制剂能够激活C-RAF和随后的ERK信号传导，反而增强肿瘤细胞增殖。为了规避选择性B-RAF激酶抑制剂的限制，一系列泛RAF激酶抑制被开发出来，如索拉非尼[16]。索拉非尼是一种泛RAF激酶抑制剂，其抑制BRAF激酶并驱动CRAF激活，但其同时结合并抑制CRAF激酶，因此不激活ERK[17]。本研究中采用的PLC/PRF/5细胞系，具有K-RAS-mutant及B-RAF wild type的基因表型，推测该细胞癌变的原因与MAPK通路受干扰有关。本研究显示，RAF/MEK/ERK信号通路对CBI-5725或索拉非尼的敏感性相当。CBI-5725不激活ERK，因此，其可能与索拉非尼一样，是泛RAF激酶抑制剂，且抑制RAF/MEK/ERK信号通路的效果与索拉非尼类似。

在本研究中，Annexin V-FITC/PI检测了CBI-5725诱导的剂量依赖性的PLC/PRF/5细胞凋亡，且CBI-5725比索拉非尼更能有效地诱导细胞凋亡。Caspases是细胞凋亡途径的基础，是细胞凋亡的启动者和执行者。Caspases可以通过两种常见的途径被激活。内在和外在途径都汇集于下游的Caspase-3。一旦被激活，caspase-3前体被切割，产生了caspase-3的活性形式，负责切割PARP[18-20]。 PARP在转录和细胞周期调控、DNA损伤反应、凋亡和基因组完整性维护方面起重要作用[21]。 PARP的切割促进细胞破坏，并且是细胞凋亡的标志[22]。用CBI-5725处理细胞后，caspase-3前体和PARP水平降低，而切割的PARP片段水平升高，表明CBI-5725依赖caspases途径在PLC/PRF/5细胞中诱导凋亡。然而，索拉非尼没有显著改变caspase-3前体、PARP和切割的PARP片段的水平，表明索拉非尼诱导的细胞凋亡可能不依赖caspases的活化。这个结果与以前的研究结果一致[3]。

在PLC/PRF/5小鼠肿瘤模型中，CBI-5725可有效防止肿瘤生长。在口服给药14 d后，6～18 mg/kg 的CBI-5725几乎完全抑制肿瘤的生长。 另一方面，甲苯磺酸索拉非尼在剂量高达20 mg/kg时，仍未完全抑制肿瘤生长。从体外实验获得的结果提示，RAF/MEK/ERK信号通路的阻断和细胞凋亡可能是CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠肿瘤模型的肿瘤生长的原因。

表1 不可切除肝细胞癌分子靶向治疗

总之，本研究表明，CBI-5725抑制RAF/MEK/ERK信号通路，效果与索拉非尼近似，CBI-5725比索拉非尼更能诱导肿瘤细胞凋亡，其机制与启动caspase-3诱导的细胞凋亡有关。这些因素都使得CBI-5725比索拉非尼更能有效地抑制PLC/PRF/5的增殖。这些因素可能有助于CBI-5725对人类HCC小鼠肿瘤模型的显著抗肿瘤功效。 因此，CBI-5725可能成为一种有效的抗肿瘤药物，替代索拉非尼用于肝癌患者。