五味子多糖对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

(1 临沂市中医医院，山东 临沂 276000；2 山东中医药大学，山东 济南 250355)

恶性肿瘤是人类健康的主要杀手之一，1971年，Folkman指出肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。当肿瘤生长到一定体积时需要新生血管为其输送营养物质并运走代谢废物，可以通过一种有效的血管生成抑制剂切断肿瘤的营养供给，从而起到抑制肿瘤生长和转移的作用。因此，以肿瘤新生血管为靶点，开发高效、低毒、价廉的抗肿瘤药物已经成为国内外学者研究的热点[1-2]。五味子，木兰科植物五味子的干燥成熟果实，具有滋补强壮之力，药用价值极高，主要的有效成分包括挥发油、鞣质、色素、多糖等，其中五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharide，SCP)具有显著的体内抗肿瘤及血管抑制作用[3-4]。为进一步确定其血管生成抑制活性，本研究采用鸡胚绒毛尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane，CAM)模型测定了SCP对血管生成的影响，以探讨SCP体内抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 CO2恒温培养箱，HERAEUS，德国；SMZ-T2连续变倍体视显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；Canon PowerShot A640 数码相机，Canon；0.22 μm滤头；微量进样器。试剂：SCP(批号：20160506，含量：72.584%，参考文献[5]方法自制)；新洁尔灭(山东利尔康医疗科技股份有限公司)；生理盐水(山东华鲁制药有限公司)；bFGF(美国Pepro Tech Asia公司)；吸收性明胶海绵(金陵药业股份有限公司)。

1.2材料 白壳种蛋，购于山东省农科院家禽研究所，每枚重50～60 g，表面光洁，蛋壳均质，蛋形规范，无皱痕裂纹。

1.3方法

1.3.1CAM模型的建立 选择受精率大于90%、生长良好的白皮种蛋，用浸有新洁尔灭的脱脂棉擦拭鸡蛋表面，消毒后置于恒温培养箱中培养，温度37℃，培养箱内放入水盘以保持60%～70%相对湿度，并保持一定的通风换气条件。鸡蛋气室向上，每天转蛋2次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45°为宜。鸡胚孵育6 d后，用照蛋灯照蛋，挑选出发育良好的鸡胚。用75%酒精消毒后晾干。用牙科钻或砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕，用尖针在种蛋气室表面扎一小孔，在凹痕处滴少量生理盐水，用吸耳球对准气室表面的小孔轻轻吸气，此时可看到凹陷处的生理盐水下陷，即该处CAM下陷，形成假气室(区别于蛋自身的气室)。用灭菌胶布封闭假气室，制备假气室后稳定48 h。

1.3.2供试液的配制 将SCP分别用生理盐水配制成0.05、0.1 mg/mL的溶液，分别为SCP-1及SCP-2。以氢化可的松作为阳性对照，bFGF作为阴性对照。氢化可的松先以适量的无水乙醇溶解，再用生理盐水稀释成6.0 mg/mL的溶液。取2 μL bFGF加生理盐水稀释100倍，配制浓度为10 μg/mL。以上供试液均用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

1.3.3血管生成抑制试验 阴性对照组：bFGF 20 μL；阳性对照组：氢化可的松100 μL+bFGF 20 μL；SCP-1组：SCP-1 100 μL+bFGF 20 μL；SCP-2组：SCP-2 100 μL+bFGF 20 μL。将假气室上的胶布揭开，上方开1 cm2左右的口，用微量进样器按上述剂量将供试液加到1 cm2左右大小的吸收性明胶海绵上，将明胶海绵用镊子直接加到鸡胚尿囊膜上，注意小心放置，加药后用无菌胶布封口，标记后放入温度(37±1)℃的培养箱，保持60%～70%的相对湿度，继续培养48 h后，揭开无菌透明胶带，用小手术镊把假气室周围的蛋壳剥除，观察并用数码相机拍照，采用IPP(Image-Pro Plus6.0)软件分析，测定定量血管面积与蛋壳开窗处对应的CAM面积，计算出血管面积百分率。

血管面积百分率=[定量血管面积/蛋壳开窗处对应的CAM面积]×100%

2 结果

2.1SCP对CAM血管生成数量的影响 实验结果表明，随着SCP浓度的增加，抑制CAM血管生成作用有增强的趋势(见封三图1)。由图1可以清晰地看出，阴性对照组血管生长旺盛，血管分支明显增多，血管密度很大；阳性对照组血管密度明显降低，血管分支明显减少；SCP-2高低剂量组作用下使大血管变细，血管数量及其分布明显减少。

2.2SCP对CAM血管生成面积的影响 实验结果表明，血管面积有随着加样浓度增高而降低的趋势(F=54.89，P<0.01)，两两比较显示各组间均有统计学意义(q=3.91～16.91，P<0.05)。见表1。

组 别n加样浓度(mg/mL)血管面积(%)阴性对照组100.0140.23±2.41SCP-1组100.0535.54±1.98SCP-2组100.131.16±2.65阳性对照组106.028.43±1.65

3 讨论

肿瘤的发生、成长是一个复杂的由多种因素共同影响的过程，其中经历的一个阶段叫血管期，在此时期肿瘤细胞诱导血管生成促进因子表达增强，进而引起内皮细胞增殖，毛细血管由周围组织血管伸出进入肿瘤组织，为肿瘤的生长提供营养物质并运走代谢产物，肿瘤组织才得以迅速生长。由此可见，通过一种血管生成抑制剂来抑制肿瘤新生血管生成，无论对原发肿瘤的增殖还是对肿瘤的转移侵袭都具有重要的意义。

国内对SCP的研究多集中于提取工艺优化[6]，活性研究包括保肝作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、抗衰老作用等[7]。Qu等[4]首次报道了SCP能够抑制小鼠移植瘤中CD31和CD34的表达，提示SCP具有抑制肿瘤血管生成的作用。为此，本文首次采用CAM实验对SCP的体内血管抑制作用进行确证，以更好的阐释其发挥抗肿瘤作用的内在机制。

研究血管生成的模型主要有动物角膜囊(眼前房)、动物颊囊和CAM 3种，其中CAM具有实验材料易得、操作简便、实验周期短、观察指标明确等优点，是理想的药物筛选模型，已被广泛应用于新生血管生成、微循环、肿瘤生物学等方面研究[8]。本实验采用CAM模型对SCP进行测定，研究中选用同一批鸡胚、相同的孵化条件，以尽量减小误差。实验结果表明，不同浓度的SCP对血管生成均具有明显的抑制活性，浓度越高抑制活性越强。VEGF是参与肿瘤血管生成的主要调控因子，能特异地结合血管内皮细胞，促进内皮细胞生长，增加血管通透性，进而促进血管生成。bFGF可以促进血管内皮细胞迁移和增殖，促进血管内皮细胞形成管状结构，与VEGF有协同促进作用。Qu等[4]发现SCP能够下调荷瘤小鼠血清VEGF水平，提示SCP的血管抑制作用可能与抑制VEGF的分泌有关。关于SCP抑制血管生成作用更深入的机制正在进一步的研究中。