布鲁菌抗体ELISA检测方法比较试验

曹 芸,封 林,曾 政,黄 诚,黄 恒,姚 璐

(1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 渝北 401120；2.重庆市綦江区动物卫生监督所,重庆 綦江 401420)

布鲁菌病(简称“布病”)是一种严重威胁人类健康的世界性人兽共患病,本病对动物主要危害是流产和不孕,但人感染布鲁菌后,往往难以治愈。世界动物卫生组织(OIE)将其收录入多种动物共患病名录中,我国将其列为二类动物疫病[1]。据统计,全世界每年因布病造成的经济损失近30亿美元[1]。对于动物布病防控,我国主要采取检疫淘汰与免疫相结合的策略[1]。

布病检测的常规方法包括细菌学和血清学方法。细菌分离鉴定是布病流行、疫情判定及临床诊断最直接的手段,然而,该方法存在生物安全隐患,且耗时长,在大规模临床检疫检测中不适用[2]。血清学检测仍是当前诊断动物布病的主要方法,包括虎红平板凝集试验(RBT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等[3]。目前《国家布鲁菌病防治计划(2016-2020年)》中规定的布鲁菌抗体血清学确诊方法有试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)[4]。当临床开展大规模的血清学检测时,试管凝集试验不仅操作复杂、耗时长,而且存在特异性不高的问题,目前OIE已不推荐使用该方法[5]；补体结合试验虽是公认的确诊方法,但试验操作复杂,需有良好的试验设施和训练有素的人员作准确的组分滴定、试剂保存和结果判断[3-5],故在检测中并不常用；ELISA方法具有通量大、操作简便、结果易于判定等优点而被广泛用于日常检疫检测。

为了客观评价布鲁菌抗体诊断试剂,提供临床布病检测参数,本研究选取3家不同单位的ELISA试剂盒对田间采集的经CFT检验的180份血清样本(牛、羊血清各90份)分别进行检测,比较不同ELISA试剂盒之间以及试剂盒与CFT之间的符合率,确定诊断试剂盒的检测效果。

1 材料与方法

1.1 血清样本 共计180份(其中牛、羊血清各90份),由本实验室从田间采集、保存。

1.2 主要试剂 牛/羊布鲁菌间接ELISA抗体检测试剂盒(iELISA-IVDC),批号2017011；布鲁菌竞争ELISA抗体检测试剂盒(cELISA-IVDC),批号2017011；购自中国兽医药品监察所。cELISA抗体检测试剂盒(cELISA-Sva),购自Svanova公司,货号10-2701-02；iELISA抗体检测试剂盒,分别购自Svanova公司(iELISA-Sva)和IDEXX公司(iELISA-idexx),货号分别为104890和BAT1132T；补体结合试验所用的补体、溶血素、抗原、对照阴性和阳性血清,全部购自国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.3 补体结合试验所用红细胞 按参考文献[3]制备。

1.4 方法

1.4.1 符合率试验 将180份血清样本分别采用iELISA-IVDC、 cELISA-IVDC、 iELISA-Idexx、 iELISA-Sva和cELISA-Sva进行检测,并用国际贸易指定的补体结合试验(CFT)进行最终定性检测,确定试剂盒与CFT间的符合率,以及不同试剂盒之间的符合率。

1.4.2 补体结合试验 具体按动物布病诊断技术国家标准(GB/T 18646—2002)[6]及《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)“布鲁菌病补体结合试验抗原与阴、阳性血清制造及检验规程”中提及的方法进行[7]。

2 结果

2.1 不同试剂盒与CFT之间符合率,其结果见表1～表5。

表1 iELISA-IVDC试剂盒与CFT的符合率

表1结果显示,以CFT检测结果为最终判定标准,IVDC研制的iELISA-IVDC试剂盒与CFT的结果符合率为98.9%。

表2 cELISA-IVDC试剂盒与CFT的符合率

表2结果显示,以CFT检测结果为最终判定标准,IVDC研制的cELISA-IVDC试剂盒与CFT的结果符合率为96.7%。

表3 iELISA-Sva试剂盒与CFT的符合率

表3结果显示,以CFT检测结果为最终判定标准,SVANOVA研制的iELISA-Sva试剂盒与CFT的结果符合率为93.3%。

表4 cELISA-Sva试剂盒与CFT的符合率

表4结果显示,以CFT检测结果为最终判定标准,SVANOVA研制的cELISA-Sva试剂盒与CFT的结果符合率为89.4%。

表5 iELISA-Idexx试剂盒与CFT的符合率

表5结果显示,以CFT检测结果为最终判定标准,IDEXX研制的iELISA-Sva试剂盒与CFT的结果符合率为87.8%。

2.2 不同来源试剂盒间符合率,结果见表6和表7。

表6 IVDC试剂盒间的符合率比较

表6结果表明,IVDC研制的cELISA-IVDC与iELISA-IVDC抗体检测试剂盒的符合率为98.3%。

表7 SVANOVA试剂盒间的符合率比较

表7结果表明,SVANOVA研制的的cELISA-Sva试剂盒与iELISA-Sva试剂盒的符合率为91.7%。

3 讨论与结论

3.1 比较试验中采用了180份田间样品,其中经CFT检测为阳性的样本约占总数的2/3。选择3个不同生产单位的布鲁菌抗体检测诊断试剂盒对所有样品进行检测,发现不同单位生产的布病诊断试剂盒检测结果之间存在一定的差异。鉴于CFT是国际布病血清学检测公认的确诊方法,因此本试验所用样本均以CFT检测结果为最终判定标准。通过比对试验,iELISA-IVDC和cELISA-IVDC与CFT的符合率最高；对同一单位的产品,iELISA-IVDC与cELISA-IVDC之间的符合率也高于其他生产单位的布病试剂盒。对于同一单位的不同产品检测结果存在差异,分析其原因主要与iELISA与cELISA两者反应原理不同有关,iELISA仅仅检测了血清中的IgG类抗体,而cELISA同时检测了IgG和IgM两种类型的抗体,理论上cELISA检测的敏感性要高于iELISA。

3.2 对于布鲁菌抗体ELISA检测试剂盒,近年来获批的国产试剂盒主要以中国兽医药品监察所研发为主[8-10],而在我国市场销售的进口布鲁菌抗体ELISA试剂盒,包括瑞典Svanova公司的iELISA试剂盒、cELISA试剂盒以及美国IDEXX公司的iELISA试剂盒。从临床实践来看,进口的cELISA试剂盒中的单克隆抗体、iELISA试剂盒中的酶标二抗均为冻干保存,用时复溶,剩余的复溶后的单克隆抗体需-20℃保存,且保存时间有限制；国产的cELISA-IVDC/iELISA-IVDC检测试剂盒中的所有试剂均在2℃ ～8℃保存,操作简便,且不涉及抗体冻融,能更稳定且更有利于试剂盒板条的多次拆分使用。另外,进口试剂盒样本和二抗作用时间均为1 h,国产试剂盒样本和二抗作用时间均为30 min,试验用时较短。比较发现IVDC的布病试剂盒在操作时间上具有明显优势,且检测结果的符合率略高于同类进口制品,说明国产IVDC布病ELISA诊断试剂盒具有较好的应用前景。