川续断水煎剂对小鼠血清中免疫球蛋白和细胞因子的影响

李颜桃,张 雷,2,张明璀,王婷婷,唐 涛,马 跃,3,4,曹立亭,3,4

(1.西南大学动物科学学院,重庆 荣昌 402460；2.贵州省毕节市七星关区农牧局,贵州 毕节 551700；3.重庆市兽医科学工程研究中心,重庆 荣昌 402460；4.西南大学中兽医药研究所,重庆 荣昌 402460)

川续断是川续断科(Dipsacaceae)川续断属(Dipsacus)植物川续断(Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai)的干燥根,主要分布于中草药资源丰富的四川等地,其性微温,味苦辛,归肝、肾经,具有补肝肾、强筋骨和调血脉等功效[1]。《神农本草经》将其被列为上品,记载本品主伤寒,补不足,金疮,痈疡,折跌,续筋骨,妇人乳难,久服益气力；现代医学研究表明,续断具备增强免疫力、抗氧化、消炎、抗病毒等药理作用；临床上常用于治疗肝肾不足、腰肢痿软、筋伤骨折、胎动不安等疾病。川续断化学成分较复杂,主要含有的化学成分为挥发油类、生物碱类、环烯醚萜类、三萜皂苷类[2]。已有研究证实[3],川续断水煎液经离心醇沉后得到的多糖具备刺激淋巴细胞的抗补体活性和致有丝分裂的作用；石扣兰[4]研究表明,一定剂量川续断水煎剂灌胃可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能；赵连根[5]研究表明,川续断对迟发型超敏反应有抑制的作用,可使免疫抑制小鼠血中的白细胞总数恢复到正常水平。王一涛[6]研究表明,川续断能显著增强机体体液免疫功能,对机体单核吞噬细胞功能有一定促进作用。

据以往研究,川续断对骨损伤、骨质疏松、成骨细胞增殖及免疫功能、抗炎抗过敏、子宫增重等具有影响。近年来国内外对川续断研究主要集中于化学成分提取测定及对骨代谢的影响等方面,对川续断在免疫方向的研究报道相对较少。本实验选取川续断水煎剂灌胃小鼠,观察其血清中IgA、IgG、IgM、细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 含量的变化,探究川续断增强动物免疫功能的机制,并为研发以川续断为基础的新型中草药免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 中药川续断,购自重庆泰尔森制药有限公司。

1.2 实验动物 昆明系小鼠,雌雄各半,体重18～23 g,委托西南大学荣昌校区实验动物平台统一订购。

1.3 检测试剂盒 小鼠血清 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 检测试剂盒,购自南京建成生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 川续断水煎剂的制备 准确称取川续断饮片200 g,用1 000 mL蒸馏水浸泡1 h后,先文火煎煮1 h,过滤后同样方法二次煎煮。将两次药液合并后,减压浓缩至相当于生药量2 g/mL的药液,4℃保存备用。

1.4.2 实验动物及分组 选取昆明系清洁级小鼠40只,雌雄各半,体重18～22 g,随机分为5组,每组8只,禁食12 h后,分别按10 g/kg·bw(组A)、20 g/kg·bw(组 B)、30 g/kg·bw(组 C)、40 g/kg·bw(组D)灌以终浓度为2 g/mL的川续断水煎剂和生理盐水(对照组),连续给药7 d,给药剂量见表1。

表1 试验分组及给药

1.4.3 小鼠血清中免疫球蛋白及细胞因子的检测 于末次给药后7 d,对小鼠摘除眼球取血,分离血清,于-20℃保存备用,测定各组试验小鼠血清中 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α含量,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 对小鼠血清中IgA的影响 从图1中可知,与对照组相比,川续断水煎剂灌胃后均可提高试验小鼠血清中IgA水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以10 g/kg·bw剂量效果最佳。

图1 血清中IgA浓度(μg/mL)的变化

2.2 对小鼠血清中IgG的影响 从图2中可知,20、30、40 g/kg·bw川续断水煎剂灌胃后均能不同程度地升高血清中IgG的水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以20 g/kg·bw剂量效果最佳。

2.3 对小鼠血清中IgM的影响 从图3中可知,与空白对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著升高血清中IgM水平(P＜0.05),但各剂量组间差异不显著。

2.4 对小鼠血清中IL-2水平的影响 从图4中可知,与空白对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著升高血清中IL-2水平(P＜0.05),但各剂量组间差异不显著。

图2 血清中IgG浓度(mg/mL)的变化

图3 血清中IgM浓度(μg/mL)的变化

图4 血清中IL-2浓度(ng/L)的变化

2.5 对小鼠血清中IL-4水平的影响 从图5中可知,与空白对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著降低血清中IL-4水平(P＜0.05),但各剂量组间差异不显著。

2.6 对小鼠血清中IL-10水平的影响 与对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著降低血清中IL-10水平(P＜0.05),以20 g/kg·bw剂量组最明显,但各剂量组间差异不显著,见图6。

图5 血清中IL-4浓度(pg/mL)的变化

图6 血清中IL-10浓度(pg/mL)的变化

2.7 对小鼠血清中IFN-γ水平的影响 从图7中可知,与空白对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著升高血清中IFN-γ水平(P＜0.05),但各剂量组之间统计学比较差异不显著。

图7 血清中IFN-γ浓度(pg/mL)的变化

2.8 川续断水煎剂对小鼠血清TNF-α水平的影响

从图8中可知,与空白对照组相比,不同剂量的川续断水煎剂灌胃后均能显著升高血清中TNF-α水平(P＜0.05),但各剂量组之间差异不显著。

图8 血清中TNF-α浓度(ng/L)的变化

3 讨论

免疫球蛋白是一组由B细胞受到抗原刺激后增殖分化成的浆细胞产生,具有抗体活性的蛋白质,依据其化学结构和抗原性差异可分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五类[7]。IgA分为血清型和分泌型两种,可介导调理吞噬作用、发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC),同时也是机体黏膜免疫防御系统的重要成分,是防止病原体入侵机体的第一道“屏障”[8]。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,是机体抗感染免疫的主力,能够中和细菌毒素的毒性,促进单核巨噬细胞的吞噬作用,与病毒结合后使其失去感染宿主细胞的能力。IgM是抗原刺激诱导机体体液免疫应答中最先产生的免疫球蛋白,具有抗菌、抗病毒、中和毒素等生物免疫活性,在机体抗感染免疫早起发挥着重要作用。本试验发现,川续断水煎剂能提高小鼠血清中IgA、IgG和IgM的含量。提示川续断可通过提高血清中免疫球蛋白水平,从来调节机体的免疫系统,增强机体免疫功能。

在细胞免疫中,T淋巴细胞处于中心地位[9]。Th细胞前体(Th cell Precursor)可在抗原的刺激下,分化为中间阶段的Th0细胞,进而选择性分化为Thl或Th2细胞[10]。Thl淋巴细胞用于诱导细胞免疫,分泌的细胞因子主要有 IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α等；Th2细胞主要功能是刺激B淋巴细胞增殖参与机体的体液免疫,分泌的细胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等。Th1细胞所分泌的细胞因子对Th2细胞的增殖活化存在抑制作用,反之,Th2细胞分泌的IL-4、IL-10也可抑制Thl细胞的增殖活化,这两种细胞在免疫反应中发挥的作用是相互排斥的。IL-4由分化的TH2细胞产生,也是其极化的关键指导性信号。事实上,驱动和维持TH2细胞分化所涉及的许多途径取决于IL-4的诱导[11]。有研究已经证实,IL-12可促进Th0细胞向Th1细胞分化[12],诱导Th1类细胞合成IFN-成,而IL-10是IL-12的主要生理性抑制剂,在Th1类细胞分化中负向调节作用[13]。在Th1处于的优势状态,IL-10受到抑制。本试验结果表明,川续断水煎液在10～40 g/kg浓度范围内能显著升高小鼠血清TNF-α的水平(P＜0.05),与李贤让[14]在续断总皂苷在治疗骨关节炎模型的作用机制中发现,与正常组相比,模型组关节滑液中TNF-α表达量明显升高(P＜0.01)的结论相一致。试验还发现川续断水煎剂在10～40 g/kg浓度范围内,能显著提高血清中Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ水平,显著抑制Th2类细胞因子IL-4和IL-10的分泌,使机体细胞免疫以Th1类细胞处于优势应答状态,增强了机体非特异性细胞免疫功能,这与詹光杰[15]等报道,五鹤续断能够提高衰老小鼠IL-2表达水平,促进T淋巴细胞的增殖,从而提高衰老机体的免疫力的结果相符。这可能是由于增强了T淋巴细胞的转化功能,并使Th0淋巴细胞更多地向Th1细胞分化,而不是向Th2分化。而对于川续断水煎剂是如何诱导T淋巴细胞Th1细胞分化的有关基因转录和信号转导机制,有待进一步研究。