鸡巨型艾美耳球虫早熟株免疫效果试验

李瑞琪,王天成,郑明学,白 瑞,张 黎,张雪松,康慧鑫,杨洪静,雷 璇

(山西农业大学动物科技学院,山西 太谷 030801)

鸡球虫病是鸡球虫寄生在鸡肠道黏膜上皮细胞内引起的一种原虫病,对现代养禽业造成巨大经济损失。已报道有9种鸡球虫,其中巨型艾美耳球虫(E.maxima)是危害最严重的虫种之一,也是集约化养殖最常见的3种球虫之一,呈世界性分布。E.maxima寄生于鸡小肠中段,影响营养物质吸收并易引起继发性肠炎[1],对鸡的生长影响明显,若致病性强的地方虫株感染5万个卵囊/只,鸡的相对增重率可下降50%以上[2]。

目前,防治鸡球虫病的主要手段是使用抗球虫药进行化学防治。但是,药物防治面临着日益严重的三大问题：耐药虫株的迅速出现；药物残留问题；对免疫力产生抑制。疫苗免疫来防控鸡球虫病可以解决抗球虫药遇到的难题,将来必将取代化学药物在球虫病控制中占据的主导地位[3-4]。目前,国内外已有多种球虫疫苗推广并应用到养鸡生产[5]。但E.maxima不同地理株之间免疫原性差异很大,常因不同地理株的出现导致免疫失败[6]。

山西农业大学病理实验室从山东临沂某鸡场分离、鉴定获得1株E.maxima亲本株,经14代早熟选育,得到一株潜隐期缩短了11 h的E.maxima早熟株。但是该弱毒虫株对雏鸡的最小免疫剂量尚不明确,为此,本研究用不同剂量的E.maxima早熟株接种雏鸡,用亲本株进行攻毒,测定相对增重率、卵囊减少率、RLS、ACI,确定使雏鸡获得良好免疫效果的最低早熟株接种量,从而为正确使用球虫疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验虫株 巨型艾美耳球虫山东株(Msd)和巨型艾美耳球虫山东早熟株(PMsd)由山西农业大学病理实验室保存与提供。

1.2 实验动物 4日龄SPF雏鸡,公母各半,由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供SPF种鸡蛋孵化而来。

1.3 一次免疫试验 挑选体重相近的4日龄SPF鸡70只,空腹称重,随机分为7组(T1～T5、C1和C2组),每组10只,其中T1～T5组为免疫攻毒组,C1组为攻毒对照组,C2组为空白对照组。T1～T5组免疫接种 PMsd,免疫剂量分别为：50、100、200、400、600个孢子化卵囊/只,免疫后5～9 d,每天分别收集各组所有粪便,称重,测定OPG,计算卵囊产量；于11日龄(第一次免疫后第7天)空腹称重各组鸡,同时用亲本株Msd对T1～T5组和C1组进行攻毒,剂量为10×104个孢子化卵囊/只。攻毒后每日观测鸡的临床状况、死亡情况和血便堆数。攻毒后第5～7天观测各组鸡的卵囊排出量、OPG,计算卵囊减少率。攻毒后第7天称重,剖解鸡,观测小肠病变并计算RLS、相对增重率、相对保护率、卵囊减少率和ACI。

1.4 二次免疫试验 挑选体重相近的4日龄SPF鸡70只,空腹称重,随机分为7组(TT1～TT5、CC1和CC2组),每组10只,其中TT1～TT5组为二次免疫攻毒组,CC1组为攻毒对照组,CC2组为空白对照组,TT1～TT5组鸡于4日龄时进行早熟株第一次免疫,免疫剂量分别为：50、100、200、400、600 个孢子化卵囊/只,于11日龄(第一次免疫后第7天)进行第二次免疫,免疫剂量分别为：100、200、400、800、1 200个孢子化卵囊/只,第二次免疫后5～9 d,每天分别收集各组所有粪便,称重,测定OPG,计算孢子化卵囊减少率。于二次免疫后第10天(21日龄)空腹称重各组鸡,同时用亲本株Msd对TT1～TT5组和CC1组进行攻毒,剂量为10×104个孢子化卵囊/只,攻毒后观察和测定指标同一次免疫试验。

1.5 检测指标 卵囊减少率=(不免疫攻毒组卵囊平均产量-免疫攻毒组卵囊平均产量)/不免疫攻毒组卵囊平均产量×100%；相对卵囊产量(ROP)=免疫攻毒组的卵囊产量/不免疫攻毒组的卵囊产量×100%；病变记分减少率(RLS)=(不免疫攻毒组的平均病变记分-免疫攻毒组的平均病变记分)/不免疫攻毒组的平均病变记分×100%；相对增重率=(试验组鸡平均增重/空白组鸡平均增重)×100%；抗球虫指数(ACI)=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)；相对保护率(%)=(不免疫攻毒组OPG—免疫攻毒组OPG)÷不免疫攻毒组OPG×100%[8-9]。

免疫效果判定标准：E.maxima早熟株最小免疫剂量是指对强毒株产生抵抗力,达到良好免疫效果(相对增重率≥85%,RLS≥70%,卵囊减少率≥75%,相对保护率≥90%和ACI≥170)的最小免疫接种剂量。

2 试验结果

2.1 一次免疫试验 各免疫攻毒组鸡均无血便、无死亡现象。免疫剂量为50个孢子化卵囊/只时(T1组),卵囊减少率可达84.42%,说明已对鸡体产生部分免疫保护。 T2、T3、T4、T5组 RLS均≥70%,卵囊减少率≥75%,因此判定为有保护力。一次免疫剂量≤300个孢子化卵囊/只的T1、T2、T3组的相对免疫保护率＜90%。而免疫剂量为400个孢子化卵囊/只及以上时,相对增重率≥85%,RLS≥70%,卵囊减少率≥75%,相对保护率≥90%,抗球虫指数≥170,符合标准,说明免疫剂量为400个孢子化卵囊/只时,早熟株可达到良好免疫效果,具备良好的免疫原性,可将早熟株一次免疫的最小免疫剂量定为400个孢子化卵囊/只(见表1和图1)。

2.2 二次免疫试验 各免疫攻毒组和空白组鸡均无血便、无死亡现象。TT1组RLS为66.67%,孢子化卵囊减少率为93.29%,ACI为173.34,说明已对鸡体产生一定免疫保护。 TT2、TT3、TT4、TT5组的 RLS≥70%、卵囊减少率≥75%、相对增重率≥85%,ACI≥170,均达到了良好免疫效果。故早熟株两次免疫的最小免疫剂量可定为一免100个孢子化卵囊/只、二免200个孢子化卵囊/只(见表2及图2)。

图1 一次免疫不同剂量E.maxima早熟株对抗球虫指数的影响

表1 E.maxima早熟株一次免疫保护效果

2.3 E.maxima早熟株一次免疫对雏鸡生长性能及卵囊产量的影响 在一次免疫期间(4～11日龄)试验鸡群的精神状态未见异常,随着免疫剂量增加,免疫组鸡平均增重、相对增重率均下降。免疫剂量在50～600个孢子化卵囊/只时,早熟株组鸡的相对增重率均在90%以上；免疫接种后卵囊产量呈上升趋势。各免疫组鸡无死亡、无血便现象,见表3。

表2 E.maxima早熟株二次免疫保护效果

图2 二次免疫不同剂量E.maxima早熟株对抗球虫指数的影响

表3 一次免疫对鸡生长性能及孢子化卵囊产量的影响

2.4 E.maxima早熟株二次免疫对雏鸡生长性能的影响 在两次免疫期间(4～21日龄)试验鸡群的精神状态未见异常,随着免疫剂量增加,二次免疫组鸡平均增重、相对增重率均下降,一免/二免剂量在50个孢子化卵囊/100～400个孢子化卵囊/800个孢子化卵囊/只时,鸡相对增重率均在90%以上；各组鸡无死亡、无血便现象,见表4。

表4 二次免疫对雏鸡生长性能影响

3 讨论

本试验结果表明,用不同免疫剂量的E.maxima早熟株对试验雏鸡进行一次免疫,免疫后以10×104个孢子化卵囊/只同源亲本株攻毒,各免疫组的卵囊产量比非免疫攻毒组明显减少。表明E.maxima早熟株(PMsd)具有良好免疫原性,不同免疫剂量均能诱发雏鸡产生保护力。

本试验对E.maxima早熟株一次免疫与二次免疫效果进行比较分析发现,二次免疫组攻毒后相对增重率、卵囊减少率、相对保护率、ACI值高于一次免疫组；当免疫剂量为一免50～200个孢子化卵囊/只,二免剂量为100～400个孢子化卵囊/只时,二免组的RLS高于一免组；二免后ROP低于一免组。无论对4日龄SPF鸡进行一次免疫还是先后进行两次免疫,随着免疫剂量的增加,免疫攻毒组鸡的ROP降低,相对增重率、卵囊减少率、相对保护率、RLS、ACI等升高,产生的免疫保护力越大,但疫苗株对雏鸡增重的不良影响也越大。进行两次免疫的效果优于只进行一次免疫。

杜爱芳等[10]研究了GC02鸡球虫疫苗的免疫效果,结果表明二次免疫的效果优于一次免疫和三次免疫；二次免疫能有效地控制鸡球虫病的发生,并对雏鸡有明显的促生长作用。卞国志等(2006)[11]研究了不同免疫剂量和免疫次数对鸡毒害艾美耳球虫免疫保护力的影响,表明在笼养条件下,2次免疫处理组各项指标明显优于1次免疫组,由于较少或基本缺乏卵囊的循环感染,1次免疫后所激发的免疫力持续时间较短,要达到球虫病的免疫控制,以进行2次免疫接种为好。

本试验以分离诱导的山东E.maxima早熟株对同源强毒株的免疫效果进行了研究,结果表明,该早熟株一次免疫的最小免疫剂量为400个孢子化卵囊/只；两次免疫的最小免疫剂量为一免100个孢子化卵囊/只、二免200个孢子化卵囊/只,为研制适合一定区域的球虫地方疫苗提供新的疫苗虫株和理论依据。