牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

梅 力,李永清,宋彦军,高晓龙,李 佳,杨春江,韦海涛,于在江,王 林,冯小宇

(1.北京市动物疫病预防控制中心,北京 大兴 102629；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 海淀 100097；3.北京纳百生物科技有限公司,北京 大兴 100176)

牛传染性鼻气管炎(IBR),是由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上分呼吸道、生殖道、脑、结膜等多种感染类型。呼吸道型以呼吸道黏膜发炎、水肿、出血和坏死为特征；生殖道型以生殖器官出现小脓包病变为特征,表现为脓疱性外阴阴道炎和龟头包皮炎,成年母牛还常伴有乳房炎、流产、受孕率降低和产奶量下降等症状；脑膜炎型主要发生于犊牛,表现共济失调、角弓反张等脑炎症状；结膜炎型主要表现眼结膜充血、水肿和点状坏死,眼部出现浆液性或脓性分泌物。该病死亡率较低,多呈亚临床经过,但易继发细菌感染,导致支气管肺炎等严重呼吸道疾病。王志亮等人通过对来自北京、天津、陕西、山西、山东、新疆、河南、河北等地l1个奶牛场的996份血清样品进行IBRV抗体检测,共检测出阳性血清120份,群阳性率为 77.8%,最高阳性率达55.0%,结果显示,大部分牛场都存在不同程度的IBRV感染。由此可见,牛传染性鼻气管炎发病率较高,且在我国分布极广[1]。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因组为线性双股RNA,整个基因组编码33个结构蛋白和15个非结构蛋白[2]。所有蛋白中4个糖蛋白、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原,而gD蛋白被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子,是IBRV的主要结构蛋白,是IBRV复制的必需基因,是刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白,它不但能诱导体液免疫,还可诱导细胞免疫[3],是目前IBRV特异性诊断的主要抗原。

IBRV的诊断检测主要依赖于经典的病毒分离培养[4]、免疫荧光[5]、ELISA[6-7]和分子生物学检测手段如PCR[8]等,但这些方法均需依赖专业仪器设备及实验人员的精细操作,且成本高昂,无法在基层养殖场开展。胶体金技术自1971年被引入到免疫化学中,已经作为一种免疫标记技术而被广泛使用。胶体金作为标记物不存在内源酶干扰及放射性同位素污染问题,且利用不同颗粒大小的胶体金还可以做双重甚至多重标记,使定位更加精确。由于胶体金作为标记物有很多优点,因此自该技术问世以来在国内外的许多研究领域中得到了迅速发展[9]。本试验利用昆虫细胞-杆状病毒表达体系重组表达gD蛋白抗原,以此建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心免疫胶体金快速检测方法,为疫病防控提供了有效检测手段,可以极大地改善当前IBRV的防控状况。

1 材料与方法

1.1 试验样品 实验用标准阴、阳性血清来源于中国兽医药品监察所,牛传染性鼻气管炎病毒及血清样本由本实验室保存。

1.2 主要仪器设备 PCR仪(Thermo公司)；纯水仪(密理博公司)；培养箱(上海博讯实业有限公司)；紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)；凝胶成像系统(北京昊诺斯科技有限公司)；天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司)；蛋白纯化仪(GE primer公司)；胶体金切条机(上海韩感电子有限公司)；划膜仪(Biodot公司)；超声破碎仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.3 主要试剂及材料 质粒pUC-gD(基因片段包括IBRV的gD碱基)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DH5α感受态细胞,购自北京天根生物工程技术有限公司；杆状病毒表达载体pFastBac HT-B和DH10Bac感受态细胞由本实验室保存；羊抗牛二抗,购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂和材料包括：氯金酸(Sigma公司)；蛋白稳定剂(上海西宝生物科技有限公司)；NC膜及其他胶体金材料(上海捷宁生物工程有限公司)。

牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒(货号：99-41299,美国IDEXX产品)。

其他试剂,均购自国药集团化学试剂北京有限公司。

1.4 方法

1.4.1 gD重组蛋白杆状病毒系统表达 参照Gen-Bank中登陆的IBRV基因序列设计引物,用于克隆p80基因片段,在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。gD基因片段以pUC-gD质粒为模板,用PCR方法扩增。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s,退火条件为55.6℃ 45 s,72℃延伸2 min,扩增30个循环；72℃延伸7 min；4℃终止反应。纯化的PCR产物与表达载体pFastBac HT-B分别进行双酶切后,用T4 DNA连接酶4℃连接过夜,连接产物转化DH5α感受态细胞。阳性重组质粒命名为 pFastBac HT-gD。将阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆,提取Bacmid,转染SF9昆虫细胞,观察转染后细胞病变并收集重组杆状病毒。培养上清和细胞裂解液煮样后进行SDS-PAGE电泳,通过湿法转印至NC膜上,进行Western Blot检测。用1∶100稀释的IBRV阳性牛血清作为一抗,同时设阴性牛血清对照,37℃孵育2 h,TBST洗涤3次,10 min/次,将HRP标记的兔抗牛抗体作为二抗,用TBST进行1∶5 000倍稀释,37℃孵育1h,再用TBST洗涤3次,10min/次。DAB显色,去离子水终止反应。拍照保存检测结果。

1.4.2 gD蛋白纯化鉴定 将重组杆状病毒以MOI 0.1感染SF9昆虫细胞,4 d后以5 000 r/min离心10 min,收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行,纯化后蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定浓度并分装,-80℃保存备用。

1.4.3 gD蛋白胶体金标记 采用柠檬酸三钠还原法制备得到40 nm范围的胶体金颗粒溶液,调节pH值至9.0备用。取一定量的胶体金颗粒溶液,置于磁力搅拌器上,将纯化后的gD蛋白抗原用PBS按照1∶2 000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60 min,将PEG 20 000溶液加入混合反应液中,使PEG的最终浓度约为1%,置于冷冻离心机(4℃)上慢速(速度为11 000r/min～13 000 r/min)离心10 min后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液。将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮,使最终的蛋白浓度约为50 μg/mL左右,保存于4℃备用。

1.4.4 IBRV双抗原夹心胶体金检测方法的建立

1.4.4.1 金标垫的制备 金标垫采用聚酯膜,经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后,将制备好的胶体金标记抗原按照40 μL喷涂,37℃烘干2 h备用。

1.4.4.2 样品垫的制备 样品垫采用聚酯纤维垫,采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用。

1.4.4.3 检测线和质控线包被 检测线标记物为gD抗原,质控线标记物为羊抗牛二抗。分别将检测抗原和羊抗牛二抗用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.8 mg/mL和1.2 mg/mL溶液,然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上,37℃烘干1 h备用。

1.4.4.4 试纸条组装 试纸条的组装按照图1模式进行。其中PVC背板、吸水垫为常规材料。组装好的大板用切条机切成7 mm的裸条备用。

图1 胶体金试纸条组装图

1.4.4.5 试纸条检测 将待测样本以PBS稀释100倍后用于检测。检测时取200 μL稀释好的样本至反应微孔中,插入试纸条,确保金标端插入液面,计时5 min后观察结果。阴性结果为质控线显色,而检测线不显色；阳性结果为质控线显色,检测线也显色。超过10 min观察结果无效。

1.4.4.6 灵敏度试验 将标准阳性血清用PBS按照 1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000 进行稀释,用制备的试纸条进行检测,以能够检测出的阳性血清的最高稀释度作为本试纸条的灵敏度。

1.4.4.7 特异性试验口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阴性血清和阳性血清由本实验室保存,用建立的胶体金试纸条对以上两种病毒的阴、阳性血清进行特异性交叉试验,同时设IBRV标准阴阳性血清对照,以评价该试纸条的特异性。

1.2.4.8 稳定性试验 将制备的试纸条生产5个批次成品,分别置于-20℃、室温、37℃持续保存7 d。7 d后取出,对稀释100倍的标准阴、阳性血清进行检测,单个样本重复5次,以检测结果的一致性判断试纸条的稳定性。

1.4.4.9 与其他试剂盒的比对试验 选取112份牛血清样品,使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时进行检测,分别计算阳性符合率、阴性符合率和总符合率,对试纸条的检测效果进行评估。

2 结果与讨论

2.1 gD蛋白重组表达及鉴定 对阳性重组质粒pFastBac HT-gD进行PCR鉴定,牛传染性鼻气管炎病毒gD基因片段大小为1 170 bp,以提取的重组质粒为模板,进行PCR检测,获得了与预期大小一致的1 170 bp特异性目的条带,如图2所示。

图2 重组质粒PCR扩增电泳图

经SDS-PAGE检测重组表达的gD蛋白,均可见诱导表达重组菌株比诱导的空载体在57 kD处多出一条明显的表达条带,且与预期大小一致,如图3所示。

重组gD蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上进行免疫印迹检测。检测结果显示,重组gD蛋白与IBRV阳性牛血清在预期的57 kD处出现特异性反应条带,与阴性牛血清无特异性条带,如中插彩版图4所示,由此表明,重组表达的gD蛋白具有良好的抗原性。

图4 Western Blot鉴定重组gD蛋白抗原性结果

2.2 gD蛋白胶体金标记 使用胶体金颗粒对制备的gD蛋白进行标记,调节蛋白终浓度为50 μg/mL,标记的gD蛋白可稳定保存于4℃也没有发生沉淀现象,因此可用于后续试验的标记。

图3 重组gD蛋白SDS-PAGE鉴定图

2.3 胶体金检测方法的建立

2.3.1 胶体金检测结果 胶体金试纸条对IBRV阳性血清和阴性血清的检测结果如中插彩版图5所示。其中A为试纸条的质控条线,B为阳性血清的检测结果条线,C为阴性血清的检测结果条线。

图5 IBRV阴阳性血清的胶体金试纸条检测结果示例

2.3.2 灵敏度试验 将标准阳性血清用PBS按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000 进行稀释,用制备的试纸条进行检测,以能够检测出的阳性血清的最高稀释度作为本试纸条的灵敏度。从表1可知,当标准阳性血清稀释至1∶500时,胶体金试纸条的检测结果为阳性,而稀释至1∶1 000时,胶体金试纸条的检测结果为阴性,表明本研究制备的胶体金试纸条的检测灵敏度为标准阳性血清稀释至 1∶500。

表1 IBRV抗体胶体金试纸条灵敏度试验结果

2.3.3 特异性试验 使用建立的胶体金试纸条对IBRV、FMDV、BVDV阳性血清和阴性血清进行检测,除IBRV阳性血清外,其他检测结果均为阴性,如表2所示,说明本试纸条特异性良好,可以特异地识别IBRV抗体。

表2 IBRV抗体胶体金试纸条特异性试验结果

2.3.4 稳定性试验 将5批次不同温度储存的试纸条分别用标准阳性血清和标准阴性血清进行检测,结果如表3。检测结果表明,低温冻存对试纸条的检测结果影响较大,而室温和37℃对试纸条检测结果无明显影响,说明本试纸条具有较好的稳定性。

表3 IBRV抗体胶体金试纸条稳定性试验结果

2.4 与国外试剂盒检测结果对比 使用IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒和建立的胶体金试纸条对112份牛血清样本进行重复检测,从结果中可看出使用胶体金试纸条检测出阳性样品60份,阳性检出率为53.6%,检测出阴性样品52份,阴性检出率为46.4%。而用IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒检测出阳性样品62份,阳性检出率为55.4%,检测出阴性样品为50份,阴性检出率为44.6%。其中两种方法检测共为阳性的样品为58份,共为阴性的样品为48份,即阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%,可见制备的胶体金试纸条与商品化的ELISA试剂盒具有较高的符合率,结果见表4。

表4 IBRV抗体胶体金试纸条与IDEXX抗体检测试剂盒符合率的比较

3 讨论

牛传染性鼻气管炎自1955年首次报道以来,每年在全球各地都有感染报道出现[10],我国于1981年首次发现并报道了该病[11]。目前牛传染性鼻气管炎在不同国家和地区均呈现出不同程度的发病和流行,这给全球养牛业都造成了严重影响。该病在我国被认定为二类传染病,也是国际动物贸易及进出境动物检疫中的重点检查疫病[12]。牛传染性鼻气管炎病毒是引起牛传染性鼻气管炎的主要病原,、gC、gD和gE蛋白是IBRV的主要病毒蛋白,其中gD蛋白又是牛传染性鼻气管炎病毒最主要的抗原蛋白,是刺激机体产生中和抗体的主要结构蛋白,丁国伟指出,抗gD蛋白的单克隆抗体能够中和吸附在宿主细胞表面的病毒,并且中和滴度较高,因此可将gD蛋白作为牛传染性鼻气管炎亚单位疫苗和诊断试剂研制的首选蛋白[13]。

本研究构建了牛传染性鼻气管炎病毒gD重组蛋白表达菌株pET-28a(+)-IBRVgD/BL21(DE3),经过鉴定,其诱导表达的重组gD蛋白具有良好的抗原性和反应特异性。以此为基础,本研究成果建立了检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金快速检测试纸条,该试纸条与商品化ELISA试剂盒的检测结果无显著差异,且检测时间更短,操作更方便,因此可以有效地应用于临床快速检测,将为疫病的净化和防控提供有效工具。