丙戊茶碱对趾部切口痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化的影响

金 旭 石翊飒 张 东 武琰娇

（1兰州大学第二临床医学院麻醉医学系，兰州 730000；2兰州大学第二医院麻醉科，兰州 730030）

术后疼痛是指手术后即刻发生的急性疼痛，持续时间通常不超过7天，但控制不佳可发展为慢性疼痛综合征，不仅造成病人身心损伤，而且增加家庭和社会的经济负担。药物治疗是治疗术后急性疼痛的最主要方法，但现有镇痛药物（非甾体类、阿片类等）在缓解疼痛的同时多伴有相关副作用。多种镇痛药物及辅助药物联合应用的多模式镇痛新思路为此提供了解决方案，因此新型镇痛药物的研发及疼痛治疗新靶点的研究的重要性不言而喻。近年来，神经胶质细胞在急性疼痛向慢性疼痛转化及慢性疼痛维持过程中的作用逐渐得到重视[1～3]，并且神经胶质细胞活化抑制剂丙戊茶碱已被证实在切口痛[4～6]、神经病理性痛[7]、炎性痛[8]中发挥镇痛作用，但其作用机制尚不知晓。

ERK1/2是真核细胞内重要的信号传导激酶，与c-jun氨基末端激酶和p38激酶同属于丝裂原活化蛋白激酶家族。研究表明ERK1/2磷酸化后可调节神经元兴奋性，参与脊髓痛觉信号调制，是引起慢性疼痛过敏的关键因素，抑制其活化能缓解疼痛[9,10]，但是脊髓ERK1/2在急性疼痛过程中的作用机制尚未完全明确，其细胞定位尚未见报道。我们课题小组在趾部切口痛模型大鼠的前期研究中发现，丙戊茶碱能通过抑制脊髓c-jun氨基末端激酶[4]和p38激酶[6]活化来提高大鼠对机械刺激和热刺激的疼痛阈值，由此假设丙戊茶碱可能通过抑制脊髓ERK1/2活化来缓解术后急性痛觉过敏。

本研究采用趾部切口痛(incisional pain,IP)模型观察鞘内注射丙戊茶碱对切口痛大鼠机械痛阈、热痛阈和p-ERK1/2表达的影响，同时检测脊髓p-ERK1/2的细胞定位，探讨丙戊茶碱缓解术后急性痛觉过敏的可能分子机制，为新型镇痛药物研发提供基础理论依据。

方 法

1.实验材料

（1）实验动物

清洁级雄性SD大鼠100只，体重200～250 g，由兰州大学基础医学院动物实验中心提供。所有实验操作遵循国际疼痛学会相关指南，并且通过兰州大学第二医院伦理委员会审核批准。

（2）试剂、仪器

丙戊茶碱（美国Sigma），p-ERK1/2（美国Cell Signaling Technology），t-ERK1/2（美国Proteintech），GAPDH（北京Solarbio），NeuN（美国Abcam），GFAP（武汉博士德），Iba-1（美国Proteintech）等。Plantar Test（意大利UGO BASILE，37370），Von Frey纤维丝（美国North Coast Medical），冰冻切片机（德国Leica，CM1950），荧光显微镜（日本OLYMPUS，BX51），电泳仪（美国BIO-RAD）等。

2.实验方法

（1）实验分组及给药

清洁级雄性SD大鼠100只按随机数字表法分为4组，每组25只，分别为空白对照组（C组）；切口痛模型组（IP组）；生理盐水组（NS组）；丙戊茶碱组（PPF组）。IP组、NS组和PPF组均制备左后肢趾部切口痛模型；NS组和PPF组分别于术前30 min鞘内注射NS 10 μl和PPF 10 μg/10 μl，C组和IP组不作鞘内注射。

（2）趾部切口模型制备

按照Brennan方法[11]制备趾部切口痛模型：大鼠乙醚吸入麻醉，消毒左后肢趾部，自左后足跟0.5 cm处向趾端作约1 cm长的纵行切口；切开皮肤和筋膜后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割一次，注意保持肌肉附着完整并不损伤血管和神经；切割完成后轻压止血，用3-0丝线缝合皮肤两针，再次消毒皮肤，单笼饲养。手术用时约3 min。为保持一致性，所有模型制备均由同一人完成。

（3）行为学测定

各组分别在术前、术后2、4、8、24、72 h随机抽取（抽签法）10只大鼠进行MWT和TWL测定。MWT：按照Dixon建立的“up and down”方法[12]进行测定。将大鼠单独放入底部为金属网格的有机玻璃箱内适应10～15 min后，用Von Frey纤维丝垂直刺激切口旁皮肤6～8 s，刺激间隔至少30 s，若5次刺激出现3次快速缩足或舔足反应记为疼痛X，给予低一级强度刺激，反之记为O，给予高一级强度刺激。初始刺激强度为2.0 g，刺激强度范围为0.4～15 g，超出范围直接记为15 g或0.4 g。当出现反应不同时再依序测量4次，共得到一组6个字符的数据（除XXXXX和OOOOOO外），将最末刺激强度代入公式计算得到MWT。MWT值越低，表示大鼠对机械刺激的痛觉过敏越严重。TWL：按照Hargreaves方法[13]进行测定。在无日光直射环境中，将大鼠单独放入底部透明的有机玻璃箱内适应10～15 min后，用热辐射刺激仪热源垂直照射切口旁皮肤，记录照射开始至大鼠抬足时间，终止时间为30 s，测定时保持刺激强度相同。重复测定3次，每次间隔至少5 min，取3次平均值为TWL。TWL值越低，表示大鼠对热刺激的痛觉过敏越严重。测定时需保持环境安静。

（4）蛋白印迹分析

各组于术前、术后2、4、24、72 h行为学测定完毕后随机选取3只大鼠，行颈椎脱臼处死后立即取出脊髓L4-6节段，称重后冰上裂解30 min；12 000 rpm离心20 min，取上清液加入1/3体积上样缓冲液，煮沸5 min后得到蛋白样品。上样电泳，湿转法转膜；5%脱脂奶粉（含5%胎牛血清）室温封闭2 h，一抗(p-ERK1/2,1:1 000; t-ERK1/2,1:3 000; GAPDH,1:2 000) 4℃震荡孵育过夜；次日于室温震荡复温后TBST洗3次，每次10 min；二抗（辣根素过氧化物酶标记，1:5 000）室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；暗室内滴加ECL发光液发光，胶片显影。使用Image J软件测定免疫蛋白印迹条带平均光密度值，p-ERK1/2与t-ERK1/2比值为p-ERK1/2相对表达量，t-ERK1/2与GAPDH比值为t-ERK1/2相对表达量。

（5）免疫荧光染色法

各组于术后p-ERK1/2表达量最高时（参照免疫印迹分析结果）随机选取3只大鼠，腹腔内注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，立即暴露心脏并经心尖穿刺插管至升主动脉，顺序灌注预冷生理盐水和4%多聚甲醛，暴露并切取脊髓L4-6节段，浸入4%多聚甲醛后固定过夜，再依次浸入20%、30%蔗糖溶液梯度脱水至沉底，冰冻切片，每片厚10 μm。荧光染色法（漂片法）：PBS (0.01 M，pH7.4)洗片3次，每次10 min；10%山羊血清室温封闭2 h，加一抗p-ERK1/2 (1:100) 4℃过夜；次日室温复温后PBS洗3次，每次10 min，加入RBITC标记(1:400)荧光二抗，室温孵育2 h，PBS洗3次，每次10 min，抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜观察并拍摄图像。荧光双染法：一抗加入p-ERK1/2 (1:100)和NeuN (1:100)或GFAP (1:1 000)或Iba-1 (1:100)，二抗加入RBITC标记（1:400)和Alexa Fluor 488 (1:400)标记荧光二抗，其余步骤同荧光染色法，置于荧光显微镜观察并拍摄相同视野下不同波长图像，使用Image J软件进行图像融合。

3.统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料表示采用均数±标准差(±SD)，行为学比较采用双因素重复测量方差分析(Two-way repeated measures,ANOVA)和t检验(Student'sttest)，Western blot结果采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.丙戊茶碱对切口痛大鼠机械痛阈和热痛阈的影响

各组大鼠术前MWT差异无统计学意义；与术前比较，C组术后各时间点MWT差异无统计学意义；与C组比较，IP组和NS组术后各时间点MWT均明显降低(P＜0.001)，PPF组术后2、4、8、24 h的MWT明显降低(P＜0.001)，术后72 h的MWT差异无统计学意义；与IP组比较，NS组术后各时间点MWT差异无统计学意义，PPF组术后2 h (P＜0.001)、4 h (P＜0.001)、8 h (P＜0.001)、24 h (P＜0.001)、72 h (P＜0.01) MWT明显升高；与NS组比较，PPF组术后各时间点MWT均明显升高（P＜0.001，见表1）。

各组大鼠术前TWL差异无统计学意义；与术前比较，C组术后各时间点TWL差异无统计学意义；与C组比较，IP组、NS组和PPF组术后各时间点TWL均明显降低(P＜0.001)；与IP组比较，NS组术后各时间点TWL差异无统计学意义，PPF组术后各时间点TWL均升高(P＜0.001)；与NS组比较，PPF组术后各时间点TWL均升高（P＜0.001，见表2）。

2.丙戊茶碱对切口痛大鼠脊髓p-ERK1/2和t-ERK1/2表达的影响

各组大鼠术前p-ERK1/2表达量差异无统计学意义；与术前比较，C组术后各时间点p-ERK1/2表达量差异无统计学意义；与C组比较，IP组术后2 h (P＜0.01)、4 h (P＜0.001)、24 h (P＜0.05) p-ERK1/2表达增加，术后72 h表达减少(P＜0.01)；与IP组比较，NS组术后各时间点p-ERK1/2表达量差异无统计学意义；与IP组比较，PPF组术后2、4、24 h的p-ERK1/2表达减少(P＜0.01)，术后72 h表达量差异无统计学意义；与NS组比较，PPF组术后2、4、24 h的p-ERK1/2表达减少(P＜0.01)，术后72 h表达量差异无统计学意义（见图1A）。

与C组比较，各组各时间点t-ERK1/2表达量差异无统计学意义（见图1B）。

3.趾部切口痛大鼠脊髓p-ERK1/2表达、细胞定位及丙戊茶碱的影响

蛋白印迹分析结果显示大鼠脊髓p-ERK1/2于术后4 h表达量最多，此时应用免疫荧光法显示p-ERK1/2主要表达于脊髓背角浅层（见图2）。免疫荧光双染结果显示p-ERK1/2与神经元标记物NeuN、星型胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物Iba-1共表达（见图3）。

表1 各组大鼠不同时间点MWT的变化(n = 10,±SD)Table1 The change of MWT at different time points in each group (n = 10,±SD)

表1 各组大鼠不同时间点MWT的变化(n = 10,±SD)Table1 The change of MWT at different time points in each group (n = 10,±SD)

*P＜0.001，与C组比较；#P＜0.01，与IP组比较；△P＜0.001，与NS组比较*P＜0.001,compared with group C; #P＜0.01,compared with group IP; △P＜0.001,compared with group NS.

组别Group 13.16±1.11 13.39±1.1013.12±1.2613.34±1.1513.17±1.2213.03±1.12 IP13.34±1.30 1.94±0.90* 0.66±0.31* 2.14±0.74* 4.11±0.97* 9.39±0.63*NS12.81±0.99 2.09±0.62* 0.85±0.37* 2.09±0.69* 4.19±0.78* 9.13±0.91*PPF13.30±1.19 3.93±0.50*#△ 2.98±0.63*#△3.76±0.65*#△ 7.19±1.05*#△ 11.63±1.45#△基础阈值(g)Baseline术后机械缩足阈MWT after operation (g)2 h4 h8 h24 h72 h C

表2 各组大鼠不同时间点TWL的变化 (n = 10,±SD)Table2 The change of TWL at different time points in each group (n = 10,±SD)

表2 各组大鼠不同时间点TWL的变化 (n = 10,±SD)Table2 The change of TWL at different time points in each group (n = 10,±SD)

*P＜0.001，与C组比较；#P＜0.001，与IP组比较；△P＜0.001，与NS组比较*P＜0.001,compared with group C; #P＜0.001,compared with group IP; △P＜0.001,compared with group NS.

组别Group 25.68±1.7325.19±1.5425.15±1.3925.13±1.6124.68±1.1925.41±1.51 IP25.10±1.04 6.33±0.95* 4.37±0.89* 6.20±0.79* 8.07±1.01*18.25±1.30*NS25.96±0.90 7.00±0.71* 4.36±0.95* 6.17±0.78* 8.23±0.77*18.82±1.00*PPF25.40±1.4312.03±1.11*#△ 8.31±0.83*#△11.46±1.23*#△15.31±1.04*#△23.07±1.08*#△基础阈值(s)Baseline术后热缩足潜伏期TWL after operation (s)2 h4 h8 h24 h72 h C

图1 丙戊茶碱对大鼠不同时间点p-ERK1/2和t-ERK1/2表达的影响(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，与C组比较；##P ＜ 0.01，与IP组比较；△△P ＜ 0.01，与NS组比较Fig.1 Effect of PPF on expression of p-ERK1/2 and t-ERK1/2 at different time points (n = 3,±SD)*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001,compared with group C; ##P ＜ 0.01,compared with group IP; △△P ＜ 0.01,compared with group NS.

讨 论

研究采用Brennan建立的大鼠趾部切口痛模型，操作过程简单、可重复性高，是目前研究术后急性疼痛的经典模型之一。本实验中大鼠表现为切割侧后爪不负重或悬空，常缩拢并紧贴于下腹部，行走时步态呈跛行；与C组比较，IP组大鼠术后各时间点MWT和TWL均明显降低，这与文献报道[11]及本课题组早期研究结果[4～6]一致，提示模型制备成功。同时通过在实验中比较NS组和IP组，排除鞘内注射操作和丙戊茶碱溶媒（生理盐水）对行为学测定和免疫学检测的干扰。

图2 术后4 h各组大鼠脊髓p-ERK1/2表达Fig.2 Expression of p-ERK1/2 in spinal cord of rats in each group at 4 h after operation

图3 术后4 h大鼠脊髓p-ERK1/2表达定位Fig.3 Location of p-ERK1/2 in spinal cord of rats at 4 h after operation

丙戊茶碱是甲基黄嘌呤衍生物，可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活化来抑制胶质细胞活化[14]，继而影响胶质细胞内受体、离子通道的调节并抑制多种促炎细胞因子的释放[5,15]。本实验中丙戊茶碱使用剂量参照文献[4]，即10 μg于术前30 min鞘内注射。结果显示PPF组大鼠MWT和TWL较IP组均明显延长，并且术后72 h与C组比较无显著差异，说明鞘内注射丙戊茶碱可缓解大鼠在切口痛急性期的机械痛敏和热痛敏，其机制可能是丙戊茶碱抑制星型胶质细胞和小胶质细胞并下调P物质、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β释放[5]，减少上述促炎细胞因子在脊髓局部的刺激作用，降低神经元兴奋性，缓解由趾部切割引起的急性痛觉过敏。

真核细胞内ERK1/2能被多种细胞外刺激信号激活，通过转录或非转录方式调节突触后膜上多种受体和离子通道的功能，改变突触可塑性，在多种疼痛的产生和维持过程起重要作用[9,10]。趾部切割后IP组大鼠脊髓p-ERK1/2表达量及阳性细胞数目均增加，提示p-ERK1/2与痛敏相关，参与大鼠切口痛的调制过程。对脊髓p-ERK1/2表达时程进行分析，发现术后4 h达到高峰；术后24 h量降低，但仍高于C组；术后72 h低于C组。提示p-ERK1/2主要在切口痛的产生过程中发挥作用，而在疼痛维持过程中作用有限，推测机制与p-ERK1/2参与的非转录调节有关。p-ERK1/2能促进NMDA受体和AMPA受体磷酸化并招募AMPA受体的GluR1亚单位插入突触后膜，增强突触转运功能，细胞Ca2+内流增加，神经元兴奋性升高；p-ERK1/2参与Kv4.2钾离子通道的调制，抑制A型钾离子外向电流，突触后膜兴奋阈值降低，对外周传入刺激反应性增强[9,10]。鞘内注射丙戊茶碱后p-ERK1/2在术后2、4、24 h表达降低，提示丙戊茶碱在切口痛急性期的镇痛作用至少部分通过抑制脊髓ERK1/2活化来实现。免疫荧光双染结果分析发现C组大鼠脊髓p-ERK1/2仅在神经元少量表达，而术后4 h时p-ERK1/2在脊髓背角浅层显著活化并分布于神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞，进一步证实p-ERK1/2在切口痛的调制过程的重要性和复杂性，而因其作用受到影响的不同类型细胞的膜受体、离子通道或激酶类型还有待进一步研究。

综上所述，大鼠趾部切割后机械痛阈及热痛阈明显降低，脊髓背角浅层神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞内p-ERK1/2表达上调，而鞘内注射丙戊茶碱可抑制p-ERK1/2表达，同时显著提高大鼠机械痛阈和热痛阈，提示丙戊茶碱能通过下调脊髓背角p-ERK1/2表达来缓解切口痛大鼠急性痛觉过敏，其深入机制有待使用特异性抑制剂、基因敲除或RNA干扰等特异性技术进一步研究。