加味升降散治疗SD大鼠神经病理性疼痛的行为学观察*

谌凌燕 陈冬建 吴智兵

（1广州医科大学附属第一医院康复科，广州 510000；2南方医科大学南海医院，佛山 528200；3广州中医药大学附属第一附属医院脑病科，广州 510000）

神经病理性疼痛 (neuropathic pain,NP) 是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛，因其机制复杂，临床上尚无治疗方法可以完全治愈[1～4]。临床治疗NP的主要药物是阿片类药物、抗惊厥和抗抑郁药物，这些药物虽然可以暂时缓解疼痛，但对神经损伤的修复及再生无益，长期服用甚至有副作用，如引起神经的脱髓鞘，使神经顺应性下降等[5]。前期有学者通过改良慢性坐骨神经缩窄性损伤 (modified chronic constriction injury of the sciatic nerve,MCCI) 动物实验也表明，替米沙坦[6]、右美托咪定、舒芬太尼联合[7]、IRF8反义寡核苷酸[8]、帕瑞昔布钠、甲基强的松龙[9]、辛伐他汀[10]等西药对CCI模型大鼠的神经病理性疼痛都有一定程度的治疗作用，但均存在着治疗时效短、有复发等缺点。

本研究前期根据中医“通则不疼”的治疗理念，运用具有升降气机，通郁散结作用的名方“加味升降散”应用于临床疼痛相关疾病的治疗取得了较好的效果，临床报道也较多，如带状疱疹性神经痛、原发性三叉神经痛、神经性头痛等[11,12]。但是，针对加味升降散在治疗NP的作用机制等并不明确，且研究较少。本研究预通过构建经典的足骨神经缩窄损伤模型，通过灌胃不同剂量的加味升降散及不同治疗时间，探讨加味升降散治疗NP的作用机制，为加味升降散用于临床治疗疼痛相关疾病提供理论依据。

方 法

1.分组

雄性SD大鼠60只，体重为180～200 g，由广东省医学实验动物中心提供。安置于广州中医药大学实验动物中心饲养。实验饲料：SPF级，饲养条件：SPF级动物房，大鼠自由摄食和饮水。适应环境1周后进行实验。所有大鼠随机分为6组：正常组、假手术组，模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组，每组各10只。具体分组处理如下： ①正常组(n= 10)：无任何手术处理，正常饲养。②假手术组(n= 10)：仅暴露右侧坐骨神经主干，不结扎；不予药物处理，术后第7天开始采用同等量生理盐水灌胃，每日2次(8 am、4 pm)，连续灌胃21天。③模型对照组(n= 10)：建立右侧iCCI模型；不予药物处理，术后第7天开始采用同等量生理盐水灌胃，每日2次(8 am、4 pm)，连续灌胃21天。④低剂量治疗组(n= 10)：建立右侧iCCI模型；术后第 7 d开始给药，予2.7 g/kg的升降散加味溶液灌胃，每日2次(8 am、4 pm)，连续灌胃21天。⑤中剂量治疗组(n= 10)；建立右侧iCCI模型；术后第 7 d开始给药，予5.4 g/kg的升降散加味溶液灌胃，每日2次(8 am、4 pm)，连续灌胃21天。⑥高剂量治疗组(n= 10)；建立右侧iCCI模型；术后第 7 d开始给药，予10.8 g/kg的升降散加味溶液灌胃，每日2次(8 am、4 pm)，连续灌胃21天。

2.加味升降散的制备

加味升降散浓缩液由大黄、姜黄、僵蚕、蝉蜕、延胡索、白芍、炙甘草、按质量比4:3:2:1:1.25:1.25:0.5比例组成，将药物在粉碎机上分别粉碎后，过200目细筛。每42.75 kg混合中药制剂则加水600 L，煮沸后再煎60 min，过滤，收集药物滤液，药渣再加水500 L，同法提取60 min，过滤，合并两次滤液，离心（转速：3,600 rpm），将离心后的滤液减压浓缩（温度：60℃，压力：-0.06 MP）成32.5 L（折合生药浓度1.2 g/ml），作为升降散加味浓缩液（浓缩液于4℃下冷藏保存）。

给药剂量参照文献[13]“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，设为高、中、低三个剂量，分别为10.8 g/kg，5.4 g/kg，2.7 g/kg。最终浓缩药液生药含量小剂量升降散加味为0.27 g/ml，中剂量升降散加味为0.54 g/ml，大剂量升降散加味为1.08 g/ml，4℃冰箱保存备用。

3.模型的建立

以经典的CCI模型为基础，建立大鼠右侧改良坐骨神经慢性缩窄性损伤 (chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型。具体步骤如下：

（1）术前准备及麻醉：将大鼠称重，腹腔注射4%的水合氯醛 (400 mg/kg)麻醉后，俯卧位固定，用小动物剃毛机将右后肢大腿外侧去毛，备皮，常规络合碘消毒皮肤，铺无菌巾，术中注意保暖。

（2）坐骨神经暴露：于右侧大腿外侧中下1/3处平行股骨处分离肌肉皮肤，充分暴露坐骨神经及其3个末端分支：腓肠神经、腓总神经和胫神经。

（3）坐骨神经结扎：在坐骨神经干近分叉5 mm处，用0.4 cm×1 cm 的多孔胶片包裹神经，再用4-0丝线做4道结扎，间距约1～2 mm，以神经微下陷、肢体不抽搐为准（此部分均由同一个术者完成，以保证结扎强度的一致性）。术毕用带针慕斯线逐层缝合伤口，络合碘消毒皮肤切口，肌注青霉素4～5万 U以预防感染，置烤灯下取暖，待复苏后，送动物房单笼喂养。

手术器械于术前高压蒸汽消毒，术中注意无菌操作及大鼠的保暖，术后严密观察大鼠恢复情况，剔除术侧患肢瘫痪或出现自残现象或出现其他健康问题者。

4.观察指标

各组大鼠于术前、手术后7 d（喂药0 d）、喂药后1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d共计9个时间点进行自发行为学评分检测、机械痛阈值检测及热痛阈值检测。具体检测方法如下：

（1）自发行为学评分检测：安静环境下，将大鼠置于0.45 m×1.2 m×1.2 m大小的格子内，观察在自由活动的情况下，后肢的使用情况以及跛行程度，评分依据：0分：正常运动行为，无后爪畸形；1分：正常运动行为，但明显有后爪畸形；2分：轻度运动行为异常，有垂足现象；3分：严重运动行为异常，术侧后爪瘫痪。

（2） 机械痛阈值检测：机械痛阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT) 的测量方法：在安静的环境中，将大鼠单独放置于透明的有机玻璃体中，环境温度调节在23～25℃之间，待大鼠适应环境30 min后，以Electronic von Frey 刺激针刺激大鼠右足底，每只大鼠刺激3次，间隔大于8 s。大鼠感应到纤维丝给予的机械刺激时或纤维丝离开后出现抬足、缩足、快速甩足反应为阳性表现，记下此时的纤维丝刻度大小，即机械痛阈值；将3次读数取平均值作为MWT。

（3）热痛阈值检测：热痛阈值的测定：以热伤害性刺激诱发的大鼠缩腿回避反射潜伏期作为热痛阈的标准(热缩足潜伏期，paw withdrawal thermal latency,PWTL)。采用YLS-6B智能热板仪进行测量，具体操作步骤如下：

提前20 min开启仪器，设置合适的红外光源照射强度，测量前预热加热盘2～3 min，以确保仪器的性能稳定。

提前30 min将大鼠置于行为学测验台上（3 mm厚度的透明干燥玻璃板），用有机玻璃笼分隔开，保持测量环境的安静，温度保持在55.3℃，待大鼠适应环境并进入安静状态后开始测量。

将加热盘缓慢移到大鼠后足底正下方，通过标志线确认位置，使红外光源对准大鼠后足第2、3趾间皮肤，按下”Start”键，热痛仪自动开始计时，当大鼠感觉到疼痛而出现抬足反应时，设备自动检测到大鼠足爪位置变动而停止计时，此时的显示时间记为热痛阈值。每次照射时间小于或等于30 s。

重复测量3次，光斑直径小于或等于0.8 cm，每次之间间隔5 min，其平均值为热缩足潜伏期(PWTL)。如果动物热痛觉不敏感超过30 s为不合格，给予剔除。

测量注意事项：①测量过程中要始终保持玻璃板的干燥洁净，大鼠的尿液或粪便均会严重影响测量结果；②与机械痛阈测量一样，保证每次测量环境条件的一致性，特别是环境温度；③行为学测量应遵循随机、双盲的原则。

5.统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学描述和分析。实验数据计量资料采用均数±标准差(±SD)表示。重复测量资料采用重复测量方差分析；完全随机设计资料采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t法两两比较，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.自发疼痛行为学评分

正常组、假手术组、模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组五个组别中，分别在手术前、手术后7 d（喂药0 d）、喂药后第1 d（术后第8天）、3 d、7 d、10 d、l4 d、17 d、21 d。每组均测量10只大鼠。自发性疼痛行为学评分检测结果，见表1。

由表1中可以看出，在手术前对随机分组后的SD大鼠做疼痛行为学评分，各组大鼠均表现良好，无显著性差异。手术后7 d（喂药0 d）时，正常组和假手术组之间、以及正常组组内、假手术组组内大鼠的疼痛行为学评分都表现良好，假手术组大鼠机体也恢复良好，均无显著性差异。模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组由于手术过程中，坐骨神经均被包裹并结扎，使其疼痛持续并产生不同程度的行动异常、垂足等现象。模型对照组中，随着手术后时间的不断延长，大鼠自身机体产生耐受性和适应性，其疼痛行为异常、垂足等现象，都有一定程度的恢复，但恢复较慢。从不同时间点的角度整体观察低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组，发现随着药剂量的增加，其行为学评分都逐渐降低，行动异常、垂足等现象逐渐减少，说明加味升降散对治疗大鼠神经病理性疼痛有疗效，同时在一定药剂用量范围之内，随着药剂量的增加，在相同的时间内，治疗效果也会越明显。

2.机械痛阈值

正常组、假手术组、模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组六个组别中，分别在手术前、手术后7 d（喂药0 d）、喂药后1 d（术后8 d）、3 d、7 d、l0 d、l4 d、17 d、21 d，对手术过的右肢脚底部位进行机械痛阈值测定，每个组别测定10只大鼠，重复3次。机械痛阈值测定结果，见表2。

由表2中可以看出，在手术之前各组的机械痛阈平均值基本相同，无显著性差异(P＞ 0.05)，说明各组的SD大鼠自身并无明显区别。在手术后7 d（喂药0 d）时，除正常组外，其它组的机械痛阈值都明显降低，但在喂药之前，各组之间无明显差异(P＞ 0.05)，说明手术成功，且在各分组之间无明显手术个体性差异。整体观察假手术组和其他四组，假手术组的机械痛阈值呈现快速升高、机体恢复良好的一个变化趋势；而其他四组，则可能是由于包裹神经胶片的存在，使大鼠的疼痛感觉更持久和稳定，从而导致机械痛阈值恢复较慢。模型对照组和其他三组治疗组做对比，机械痛阈值恢复最慢，且均有显著性差异(P＜0.05)，说明加味升降散对神经病理性疼痛的机械痛阈方面也有一定程度的治疗作用。在三个治疗组之间，随着药剂用量的增加，在每一个时间点基本都表现出药剂量也大、机械痛阈值越大、治疗效果越好的变化趋势。

表1 自发性疼痛行为评分分析结果(±SD, n=10)Table 1 Analysis of spontaneous pain behavior scores (±SD, n=10)

表1 自发性疼痛行为评分分析结果(±SD, n=10)Table 1 Analysis of spontaneous pain behavior scores (±SD, n=10)

*P＜0.05,与高剂量组比较；#P＜0.05,与中剂量组比较；aP＜0.05,与0 d比较；bP＜0.05,与1 d比较；cP＜0.05,与3 d比较；dP＜0.05,与7 d比较；P＜0.05,与10 d比较；fP＜0.05,与14 d比较*P＜0.05,compared with the high-dose group; #P＜0.05,compared with middle-dose group; aP＜0.05,compared with 0 d; bP＜0.05,compared with 1 d; cP＜0.05,compared with 3 d; dP＜0.05,compared with 7 d; P＜0.05,compared with 10 d; fP＜0.05,compared with 14 d.

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(表2 机械痛阈值测定及分析结果(s) (±SD, n=10)Table 2 Mechanical pain threshold test and analysis results （±SD, n=10)

(表2 机械痛阈值测定及分析结果(s) (±SD, n=10)Table 2 Mechanical pain threshold test and analysis results （±SD, n=10)

*P＜0.05,与假手术组比较；#P＜0.05,与模型对照组比较；△P＜0.05,与低剂量对照组比较；aP＜0.05,与0 d比较；bP＜0.05,与1 d比较；cP＜0.05,与3 d比较；dP＜0.05,与7 d比较；eP＜0.05,与10 d比较；fP＜0.05,与14 d比较*P＜0.05,compared with sham-operated group; #P＜0.05,compared with model control group; △P＜0.05,compared with low-dose control group; aP＜0.05,compared with 0 d; bP＜0.05,compared with 1 d; cP＜0.05,compared with 3 d; dP＜0.05,compared with 7 d; eP＜0.05,compared with 10 d; fP＜0.05,compared with 14 d.

正常组Normal时间点Time point假手术组Sham operation模型对照组Model control低剂量治疗组Low dose treatment中剂量治疗组Middle dose treatment高剂量治疗组High dose treatment手术前Before surgery36.2±3.934.9±2.936.1±3.635.9±4.437.6±3.933.9±2.5喂药0 d Feed for 0 d34.6±4.213.2±1.610.3±1.8*11.8±1.3*10.1±1.0*11.0±2.4喂药1 d Feed for 1 d37.4±1.813.3±1.3 9.5±1.2* 9.6±0.6* 8.5±1.1a*12.1±1.2*喂药3 d Feed for 3 d35.9±3.213.7±1.410.3±1.1*10.5±1.9* 9.9±0.8a*#△13.8±1.1*喂药7 d Feed for 7 d36.7±4.117.5±2.4c11.3±0.6c*12.5±1.0*12.4±0.5a*15.3±0.8*喂药10 d Feed for 10 d33.8±2.921.6±2.3abcd11.9±0.5abcd*13.0±1.7c#13.9±0.8a#16.5±1.8#喂药14 d Feed for 14 d37.1±3.424.6±2.2ce10.8±0.6abcd*13.9±0.9abce*16.2±0.3abcde*18.2±2.1a*喂药17 d Feed for 17 d36.9±3.927.9±2.9abcdef11.4±0.7abcd*15.8±0.7df*#18.3±0.7af*#21.2±2.2*#喂药21 d Feed for 21 d34.5±4.530.1±1.2abcdefg12.9±0.6abcdefg*16.7±2.1abdefg*#23.5±3.2abcdefg*#25.1±2.4*#

3.热痛阈值

正常组、假手术组、模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组六个组别中，分别在手术前、手术后7 d（喂药0 d）、喂药后1 d、3 d、7 d、l0 d、l4 d、17 d、21 d，进行热痛阈值测定，每个组别测定10只老鼠，且重复3次，测定结果见表3。

由表3和图3可以看出，为手术之前，对比六个组别的热痛阈值，基本都维持在13 s左右，并且正常组中，各个时间点的热痛阈值也基本维持在13 s左右，各组数据之间均无显著性差异(P＜0.05)。在手术后7d（喂药0 d时），假手术组、模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组都有不同程度的下降，其中假手术组下降幅度较小，而模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组则下降幅度较大，其该四组均与假手术组之间有显著性差异(P＜0.01)。随着喂药治疗时间的延长，模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组则都有一定程度的恢复，且随着药剂量的增加，在同一个时间点时均表现为高剂量组治疗效果＞中剂量治疗效＞低剂量治疗效果。假手术组则随着时间的推移，SD大鼠机体自身也在逐渐恢复。

讨 论

iCCI模型，因其制作流程简单、损伤小，且可以出现明显、稳定的自发性疼痛、热痛觉过敏、机械疼痛超敏等症状，与人体外周神经损伤造成的神经病理性慢性疼痛的临床表现较为相似，故作为本实验的动物研究模型的基础[14]。本实验结果显示模型组与治疗组在iCCI建立初始阶段，即喂药0 d，都呈现高自发性疼痛症状、低机械疼阈值及热疼阈值，这表明iCCI动物模型构建成功。加味升降散治疗组结果显示，不同剂量的加味升降散及不同治疗时间，加味升降散治疗效果存在差异性。从自发性疼痛分析，显示，虽然随着治疗时间的延长，各组大鼠自发性疼痛评分都有明显的改善，但加味升降散治疗组表现更好的恢复效果，随着剂量的增加，在同一治疗时间，治疗效果更佳。从机械痛阈值及热痛阈值分析显示，加味升降散治疗组相比模型组都有明显的改善其疼痛阈值，且随时间的延长，效果越明显，另外高剂量的加味升降散治疗效果明显优于低剂量组。这说明加味升降散可以有效缓解和治疗神经病理性疼痛产生的自发性疼痛行为、机械刺激的敏感性和热刺激的敏感性，并且在一定的用量范围之内，随着加味升降散用量的增加，其治疗效果会越好。

表3 热痛阈值测定及分析结果(s,±SD, n=10)Table 3 Thermal pain threshold test and analysis results (s,±SD, n=10)

表3 热痛阈值测定及分析结果(s,±SD, n=10)Table 3 Thermal pain threshold test and analysis results (s,±SD, n=10)

aP＜0.05,与0 d比较；bP＜0.05,与1 d比较；cP＜0.05,与3d比较；dP＜0.05,与7 d比较；eP＜0.05,与10 d比较；fP＜0.05,与14 d比较；gP＜0.05,与17 d比较aP＜0.05,compared with 0 d; bP＜0.05,compared with 1 d; cP＜0.05,compared with 3 d; dP＜0.05,compared with 7 d; eP＜0.05,compared with 10 d;fP＜0.05,compared with 14 d; gP＜0.05,compared with 17 d.

高剂量治疗组High dose treatment手术前Before surgery13.4±2.114.0±2.313.6±1.913.2±1.513.9±2.212.7±2.7喂药0 d Feed for 0 d12.5±1.88.7±1.13.4±1.23.2±1.12.9±0.72.8±1.1喂药1 d Feed for 1 d13.6±1.49.2±2.33.8±2.43.5±3.33.8±4.33.4±2.7时间点Time point正常组Normal假手术组Sham operation模型对照组Model control低剂量治疗组Low dose treatment中剂量治疗组Middle dose treatment喂药3 d Feed for 3 d13.1±3.19.5±0.9b3.5±1.54.2±1.13.4±2.2ab4.5±1.2喂药7 d Feed for 7 d12.8±1.29.8±1.294.2±2.84.2±1.04.4±0.8bc5.9±1.2c喂药10 d Feed for 10 d14.6±1.88.9±1.44.2±1.2bcd4.6±0.9c5.2±0.9abd7.1±0.7bc喂药14 d Feed for 14 d13.2±2.49.5±1.3abcde4.9±1.4abcd5.1±1.3e5.6±1.6bd8.3±1.3bc喂药17 d Feed for 17 d14.1±2.89.8±0.9abcde5.2±0.6abcd5.9±1.06.7±0.7abd9.0±1.0喂药21 d Feed for 21 d13.5±1.910.0±0.8acde5.8±1.0abcd6.7±1.28.1±1.3bdeg8.9±1.4f

加味升降散主要成分包括大黄、姜黄、僵蚕、蝉蜕、延胡索等。其姜黄具有止疼作用，何氏报道姜黄素能减轻坐骨神经结扎(CCI)大鼠机械性痛觉过敏和热痛觉过敏[15]。另有研究证实，小鼠扭体法测定蝉蜕各部分均有明显的镇痛作用，其强度为蝉蜕整体＞身＞头足[16]。因此，加味升降散用于NP治疗其有效成分与姜黄及蝉蜕的止疼有关。根据中医学辨证分析“痛则不通，通则不痛”，研究发现NP的发生与炎症因子过量及凝血因子增加有关，导致疼痛通路受阻，从而导致疼痛[17]。根据现代药理学分析显示，Literat 等[18]证实在肺炎细胞培养基中加姜黄素能明显抑制前炎症细胞因子白细胞介素-1β、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α的表达。李氏等观察到莪术中的有效成分姜黄素具有抗血小板聚集及抗凝作用[19]。僵蚕具有活化纤溶系统，与抑制血栓形成，具有抗凝作用[19]。因此，其有效改善及治疗NP的作用机制可能与加味升降散中姜黄、僵蚕等药理活性有关。

综上所述，加味升降散可有效缓解iCCI模型大鼠疼痛效果，这与加味升降散临床应用结果相一致。通过本研究发现，随着治疗时间的延长，加味升降散治疗效果更佳；在同一治疗时间下，随着加味升降散剂量的增加，治疗效果提升。根据中医学分析及现代药理学分析，加味升降散治疗效果可能与其重要各单体组分的活性物质有关，如姜黄的镇痛及抗炎症作用及抗凝血作用。本研究结果对指导临床加味升降散临床用药具有指导作用，但其是否与其炎症作用或抗凝血作用有关，需进一步研究证实。