虾青素乳油的研究与开发——基于酵母菌的深层发酵

谭丽娟，朱文婷，陈洪彪，代万富，黄绍鸿，于 敏

(武汉工商学院 环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)

1 引言

虾青素属于一种萜烯类不饱和化合物，为一种广泛存在于生物界的酮式类胡萝卜素[1]。虾青素因具有很强的生物活性而具有广阔的应用市场，其作用包括具有抗疲劳抗氧化的作用[2]；其抗氧化与抗炎作用可保护神经元[3]；在抗肿瘤方面也有一定的作用，其机理可能与抑制PPARγ表达有关[4]；在增强免疫力及视力方面有一定的效果[5]；具有着色功能，是很好的天然红色素等。目前虾青素主要来源的菌种是雨生红球藻和红法夫酵母[6]，而所产生的虾青素产量比较低，本项目就利用酵母制备虾青素乳油，旨在提高乳油中虾青素含量，所以本课题具有一定的研究意义和价值，可为相关产品的工业化生产提供技术路线。

2 材料、试剂及培养基

菌株：酵母菌，由武汉工商学院实验教学中心环境与生物工程分中心保存。

主要试剂：DMSO(AR)、正己烷(AR)、丙酮、NaOH(AR)、二氯甲烷(AR)、石油醚(AR)、葡萄糖(BR)、酵母浸膏(BR)、蔗糖(AR)、牛肉膏(BR)，均来自天津市凯通化学试剂有限公司；虾青素标准样，Sigma公司；番茄红素，江苏采薇生物科技有限公司。

主要仪器：SPX-100B-D型振荡培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、旋转蒸发仪RE52CS(上海亚荣生化仪器厂)。

培养基：葡萄糖10 g/L；蔗糖10 g/L；酵母膏10 g/L；牛肉膏2.5 g/L；琼脂粉20 g/L。

3 实验方法

3.1 标准曲线的制作方法

用100 mg/L虾青素标准溶液和DMSO-丙酮混合液配制2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L等一系列浓度的虾青素标准溶液，在波长为478 nm的条件下分别测定其吸光度，以虾青素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

3.2 菌种活化与培养

用接种环挑取酵母菌于液体培养基中活化，活化后的菌种接于种子培养基摇瓶培养，培养条件：温度22 ℃，时间18 h，转速150 r/min。

将种子液按1∶10接入培养基，于培养箱中摇瓶培养，约25 h后取出培养瓶并向其中加入浓度分别为0 μg/g、20 μg/g、40 μg/g、60 μg/g、80 μg/g的番茄红素，以引入虾青素合成前体物质[7]，继续摇瓶培养15 h，培养条件：温度22 ℃，转速150 r/min。

3.3 虾青素的提取

3.3.1 不同破壁方法提取虾青素

分别利用机械法、化学法、自溶法对菌体进行破壁处理。机械法采用研磨法用丙酮作为助磨剂处理菌体；化学法采用DMSO溶液70 ℃条件下处理菌体；自溶法利用NaCl溶液作为质壁分离剂，在pH值为7、温度为55 ℃条件下自溶3 h，处理后离心。

3.3.2 不同破壁时间提取虾青素

取一定量离心所得的菌体，加入DMSO-丙酮混合液，在40 ℃的条件下分别破壁处理20 min、40 min、60 min、80 min、100 min。在478 nm波长下测定样品液的吸光度。

3.4 虾青素提取液的萃取与浓缩

将虾青素粗品于分液漏斗，加入约其1/2体积的石油醚，边加边振荡，静置分层后加入石油醚等体积的无水乙醇及适量蒸馏水，去除乙醇相，将石油醚相进行蒸发浓缩(条件：真空度0.08 MPa，温度30 ℃)，产品于烘箱避光干燥。

3.5 虾青素的皂化

分别配制浓度为20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L的NaOH溶液并与乙醇混合制成质量浓度为40.3 kg/m3的混合液；取浓缩干燥所得样品按1∶5溶于二氯甲烷溶液中，充分溶解后，按1∶5加入乙醇-NaOH混合液，置磁力搅拌器上进行皂化，20 min后加入适量蒸馏水直到反应混合液迅速出现分相时停止皂化反应，收集下层有色相得皂化产品，于冰箱中冷藏，待二氯甲烷相完全澄清，分液，进行真空浓缩。

分别取少量干燥后的产品溶于DMSO-丙酮混合液，在478 nm波长下测定吸光度。

3.6 制备虾青素乳油的方法

在以上考察因素最佳条件下进行发酵与提取，真空干燥得虾青素，向所得虾青素中按1∶10的比例加入大豆油，使虾青素充分溶于大豆油中，加入乙醇溶液，充分反后转入旋转蒸发仪中，将未反应的乙醇溶液蒸出，既得虾青素乳油。

4 结果与分析

4.1 标准曲线的制作

虾青素标准样的标准曲线如图1，标准曲线方程为：y=0.0855x+0.0154，R2为0.9987，表明虾青素质量浓度在0～12 μg/mL范围内线性关系良好。

4.2 前体物质对虾青素产量的影响

向各组发酵液所得菌体中加入DMSO-丙酮混合液处理20 min，测定各组样品液吸光度，得前体物质加入量与虾青素浓度关系如表1所示。从实验数据得出，向培养基中引入虾青素合成前体物质可显著增加虾青素合成率，并非前体物质加入量越多越好，在番茄红素加入量为60 μg/mL时，样品中虾青素含量最高，浓度为5.32 μg/mL，但当番茄红素加入量为80 μg/mL时，反而不利于虾青素的合成。

4.3 不同破壁方法对虾青素提取的影响

运用不同的破壁方法处理菌体，测定其中虾青素含量，得虾青素浓度与破壁方式的关系如表2所示；表明利用化学方法对菌体细胞进行破壁处理所得虾青素含量相较于研磨法和自溶法高，可达到2.29 μg/mL，故在虾青素的提取过程中宜采用化学方法对菌体细胞进行破壁处理，以提高虾青素的提取率。

表1 前体物质对虾青素合成的影响

表2 不同破壁方法对虾青素提取的影响

4.4 不同破壁时间对虾青素提取的影响结果

利用DMSO-丙酮混合液对菌体壁以不同时间处理后测定虾青素含量，得吸光度最大值为0.531，从图2知，在破壁处理过程中，处理60 min为宜；处理时间在20～60 min的时间范围内，处理时间越长，样品液中的虾青素含量越高，但处理时间超过60 min以后，样品液中虾青素的含量却有所下降。故破壁处理时，处理的时间不宜过长。

图2 不同处理时间对虾青素提取含量的影响

4.5 不同浓度的碱对皂化效果的影响

利用不同浓度的NaOH溶液对提取液进行皂化处理后于478 nm的波长下测定吸光度，得样品液中虾青素含量与碱浓度的关系如图3所示，随着碱浓度的升高，样品皂化效果越好，当碱浓度为20 g/L时，虾青素的皂化效果达到最好，其浓度为5.27 μg/mL，当碱浓度超过20 g/L时，虾青素的浓度呈下降趋势。

图3 碱浓度对虾青素皂化影响

4.6 虾青素乳油的制备

图4为试验各项考察因素最优条件下得到的虾青素乳油产品，颜色呈现为橘红色，为不透明乳状物。

图4 虾青素乳油

5 结论

通过对培养条件、提取方法的优化，可明显提高虾青素提取率；培养条件优化后得其浓度为5.32 μg/mL，相比优化前增加了2.85 μg/mL；化学方法对菌体进行破壁处理，得浓度为2.29 μg/mL，较机械法和自溶法的提取量分别增加0.69 μg/mL、1.17 μg/mL；通过对比破壁时间对虾青素提取效果，优化后得浓度为5.96μg/mL，相比优化前增加了2.02 μg/mL；通过皂化过程不同浓度NaOH溶液对虾青素提取效果的考察，优化后浓度为5.27 μg/mL，较优化前浓度提高了4.15 μg/mL；综上得前体物质、NaOH溶液浓度两个因素对虾青素的提取影响最大。通过对培养条件和提取方法的研究，使获得的虾青素浓度较近年的报道有较大提升，试验中随虾青素产率的提升，相应的虾青素在乳油中浓度也会提升，不仅降低了成本，也可为虾青素提取率的提高及其产品的制备提供技术路线，为其工业化发展奠定了基础。