UPLC-MS/MS同时测定电子烟烟液中安赛蜜等5种合成甜味剂

杨飞，李中皓，严俊，王颖，刘珊珊，邓惠敏，边照阳，范子彦，唐纲岭*

1 国家烟草质量监督检验中心，河南郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001；

2 广西中烟工业有限责任公司，广西南宁北湖南路28号 530001

电子烟是近几年来兴起的一种新型烟草制品，又称电雾化卷烟，电子烟主要由电池杆（包括发光二极管、电池、气动开关、控制电路、雾化器等元器件）和烟弹（包括贮液腔和吸嘴） 组成[1]。电子烟通过芯片和气流感应器控制烟雾输出量及工作状态，加热后，将含有烟碱和香精的溶液雾化成微粒。其中烟弹中的烟液是核心，主要成分是含烟碱的丙二醇、甘油或聚乙二醇等[2-3]。同时，为了满足不同吸烟者对电子烟产品口感与风味多样化的需求，会添加各种香精。烟液中香味成分的含量很低，却是决定电子烟感官品质最重要的因素之一[4-5]。

甜味剂是一类可以提升食品甜味和口感的添加剂，具有甜度高、热量低、价格低廉、不易发生龋齿等优点，在食品生产中应用极其广泛。GB2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定了允许使用的食品添加剂，其中安赛蜜、糖精、甜蜜素、纽甜和阿斯巴甜等5种属于最常用的人工合成食品甜味剂[6]，其化学名称和使用限量见表1。合理使用人工合成食品甜味剂是安全的，不会对食用者的健康产生风险。但如果超限量、超范围，或者使用劣质的人工合成食品甜味剂，则会对消费者的身体健康产生一定的负面影响[7-9]。因此研究电子烟烟液中多种人工合成甜味剂不仅是技术发展的需求，也是实际应用的需要。

目前，对于人工合成甜味剂的测定主要集中于饮料、白酒、乳制品等。测定方法主要有离子色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱法[12-13]、液相色谱-质谱法[14-16]等。由于人工合成甜味剂的物理化学性质、电化学性质、光谱性质的不同，液相色谱法很难满足多种甜味剂同时检测的要求，离子色谱法和毛细管电泳法也由于灵敏度低等原因应用不多。随着各国对甜味剂使用要求越来越严格，使得开发更为简单快速、灵敏度高的检测方法成为必要。由于液相色谱—串联质谱的选择性强、灵敏度高以及抗基质干扰能力强，目前已广泛应用于食品添加剂的测定[17-19]。

本研究结合超高效液相色谱-串联质谱分析速度快，灵敏度高，特异性强的优点，通过优化色谱、质谱条件，同时采用分散固相萃取净化方式，建立了电子烟烟液中多种甜味剂同时检测的高效液相色谱-串联质谱法。该方法操作简单，分析时间短和灵敏度高，适合实验室中对甜味剂的批量检测。

表1 5种甜味剂的化学名称和部分限量要求Tab.1 Chemical name and partial limit requirements of 5 sweeteners

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

10种不同品牌的电子烟烟液，编号为1#～10#，其中1#～4#为烟草原味，5#～6#为薄荷味，7#～10#为水果香型，全部通过网络购买。

安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜和纽甜标准品（＞98.0%，德国Augsburg公司）；甲酸、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂、石墨化炭黑吸附剂和C18吸附剂（40 μm，美国Agilent公司）；水为超纯水。

Waters TQD四极杆串联质谱仪[配备电喷雾电离源（ESI）]、Waters Acquity I Class超高效液相色谱 仪、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm, 1.7μm）（美国Waters公司）；VX200涡旋振荡仪（美国Labnet公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；AEl63电子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

称取0.2 g电子烟烟液（精确至0.01 g），并置于5.0 mL容量瓶中。用超纯水稀释至刻度，摇匀；移取1.5 mL溶液至2.0 mL离心管中，并加入 25 mg C18吸附剂，涡旋振荡2 min，经0.22 μm水相滤膜过滤。滤液进UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 标准工作溶液的配制

分别称取10 mg 5种甜味剂标准品，于同一个100 mL容量瓶中用超纯水定容，制得5种甜味剂质量浓度为1 00 μg·mL-1的混合标准储备液。

分别移取混合标准储备液25、50、100、200、500 μL至5个10 mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容，制得不同质量浓度的标准工作溶液。标准工作溶液中5种甜味剂质量浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg mL-1。

1.2.3 检测条件[19]

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～2 min为5% A，2～6 min为5% A～30% A，6～12 min为30% A～90% A，12～13 min为90% A；13～13.5 min为90% A～5% A；13.5～15 min为5% A；质谱扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h；锥空气流量：50 L/h；停留时间：100 ms；毛细管电压：2.8 KV；采集模式：多反应监测（MRM）。

1.3 数据分析

数据采集采用MassLynxV4.1软件。平均值、回收率和相对标准偏差的计算采用Microsoft Excel 2007 版软件。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 流动相的选择

图1 5种甜味剂的多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 5 sweeteners

分别考察水-甲醇、水-乙腈体系及其甲酸对5种甜味剂的分离影响。结果表明，甲醇和乙腈对5种甜味剂的分离效果相近，在不添加酸的情况下，5种甜味剂的峰形不对称，存在明显拖尾情况，考虑到乙腈的毒性较甲醇大，因此选用甲醇-水作为流动相，并在水溶液中加入甲酸。结果表明，在流动相中加入体积分数为0.1%的甲酸后5种甜味剂的的信号明显降低，但是色谱峰形得到明显改善。推测其原因是：糖精钠又称邻苯甲酰磺酰亚胺钠，甜蜜素其化学名称为环己基氨基磺酸钠，安赛蜜又称为乙酰磺胺酸钾，阿斯巴甜和纽甜为氨基酸的酯类，这些化合物均呈碱性，容易与C18柱残留硅醇基发生吸附作用而导致峰拖尾，采用弱酸性流动相可以改善拖尾现象。因此选择甲醇-水（0.1%甲酸）为流动相。采用优化后的色谱条件对5种甜味剂进行分析，其选择离子色谱图如图1所示，可以看出，5种甜味剂的分离效果较好。

2.1.2 质谱条件的确定

取10 mg/mL标准溶液，以蠕动注射进样方式在ESI+和ESI—模式下进行全扫描。结果显示，5种甜味剂在负离子模式下的响应值均高于正离子模式，因此选择负离子扫描。在负离子（ESI—）模式下，阿斯巴甜和纽甜[M-H]—，甜蜜素[M-Na]—, 糖精钠[M-Na-2H2O]—，安赛蜜[M-K]—丰度较高，因此将其选择为母离子。以母离子为前体离子，进行产物离子扫描，选取丰度较强、信号稳定的碎片离子作为定性和定量子离子。其中甜蜜素的母离子m/z 178.0裂解时只得到m/z 80.1一个碎片离子，因此选择178.0作为定性子离子。最后，优化毛细管电压、脱溶剂气流量、锥孔气流量、离子源温度、锥孔电压、碰撞电压等参数条件，使各个离子对的响应最高。优化得到的5种甜味剂在负离子模式下的的质谱参数如表2所示。

2.1.3 前处理条件的优化

由于不同厂家的烟液样品中乙醇、丙三醇等醇类的含量不同，在进行液相色谱分离时这些醇类会对甜味剂在色谱柱中的保留性能产生影响，导致被分析物在色谱柱上的保留作用减弱，使峰位前移，保留时间不稳定。为了消除烟液中醇类物质对分析结果的影响，且这5种甜味剂均易溶于水，所以直接用水对样品稀释后进行检测即可。稀释的方法不仅可以降低醇类对色谱峰形影响，而且可以降低基质效应，但是同时也会降低方法的检出限。经过不同稀释体积对比，最终确定稀释体积5 mL。同时为了进一步降低基质干扰，减少样品中的杂质对仪器的污染，分别采用25 mg常用的分散固相萃取材料（PSA、C18和石墨化炭黑）对稀释后的样品进行分散固相萃取净化。结果（表3）显示：C18效果最好，各甜味剂的回收率在92.6%～102.2%，且相对标准偏差小于6.0%，可以满足定量的要求；石墨化炭黑效果最差，其对所有甜味剂均有不同程度的吸附，导致回收率偏低。

表2 5种甜味剂的质谱参数Tab.2 MS parameters of 5 sweeteners

表3 分散固相萃取试剂对5种甜味剂回收率的影响（n=5）Tab.3 Effect of dispersive solid phase extraction reagent on recoveries of 5 sweeteners

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线、检出限和定量限

以5种甜味剂定量离子对的色谱峰面积（Y）（CPs）为纵坐标，标准工作溶液中5种甜味剂的浓度（X） （μg/mL）为横坐标作图，得到标准工作曲线。标准工作曲线形式为Y = AX + B，其中A和B分别表示为斜率和截距。以各种甜味剂信噪比（S/N）为3时的进样浓度确定为每种甜味剂的LOD。以各种甜味剂信噪比（S/N）为10时的进样浓度确定为每种甜味剂的LOQ。结果（表4）显示，各甜味剂在0.25～5 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.998，可以满足定量分析要求。

表4 5种甜味剂的标准工作曲线、相关系数、检出限及定量限Tab.4 Standard working curve, correlation coefficients, LODs and LOQs of 5 sweeteners

2.2.2 方法的回收率及精密度

通过加标样品的回收率实验来验证该方法的重复性，并以RSD来评价精密度。在不同浓度水平（LOQ，10倍LOQ，20倍LOQ）的加标样品上进行回收率实验。每个浓度水平重复测定6次，计算样品中各种甜味剂的回收率和RSD。结果（表5）显示，回收率在92.5%～105.2%，且RSD均小于5.0%。

2.2.3 实际样品的测定

采用本方法对市售的10款电子烟烟液样品进行了5次平行测定，结果（表6）显示：2个样品中检出有纽甜，含量分别为3.35和4.52 mg·kg-1；1个样品检出有甜蜜素，含量为2.48 mg·kg-1，且相对标准偏差均小于5.0%。图2为5#样品的选择离子色谱图。

表5 不同浓度下的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Tab.5 Recoveries and RSDs of 5 sweeteners under different concentrations (n=6)

2.2.4 方法对比

文献报道方法[16]采用超纯水超声提取，定容后过滤进行LC-MS/MS检测。采用本方法与文献报道方法对1#和8#样品进行检测和对比分析，结果（表7）显示，本方法检测结果与文献报道方法检测结果之间无明显差异，说明两种方法的一致性良好，但是本方法采用C18固相萃取净化后，样品更干净，减轻了对仪器的污染。

2.2.5 方法的耐用性

耐用性也称之为稳健性，根据GB/T 27417-2017[20]和GB/T32465-2015[21]，一个好的分析方法应该不受环境等一些因素的微小变化而变化。耐用性试验是考察环境或其他条件变量对分析方法影响的一项检验程序。进行耐用性试验的目的在于鉴别这些必须仔细控制的实验条件，并针对检测结果准确度有较大影响的因素，提出有效控制措施。通常需要考虑影响检测过程与结果的微小条件（因素）包括但不仅限于以下内容：人员、仪器、实验材料、环境等。

表6 实际样品的测定 Tab.6 The determination of real samples

图2 5#样品的选择离子色谱图Fig.2 SIM chromatograms of 5# sample

本文在不同试验条件下对1#样品进行了7因素2水平的考察，耐用性试验因素详见表8，按照表9的测试编号组合，共做8次试验，结果以s、t、u、v、y、w、x、y、z表示。数据统计以流速为例，当流速由A水平变为a水平时，对结果产生影响的分析方法为：涉及A的所有结果的平均值涉及a的所有结果的平均值由A变为a之后对结果的影响用来表示。比较7个因素的差值的绝对值，按从大到小排列，如果某个因素变化对结果有较大影响的话，那么该因素的差值绝对值将远远大于其他因素的差值绝对值，出现这种情况，应严格控制相应的检测条件，并在有关的文件中做明确的说明。

表7 不同方法的测定结果对比Tab.7 Comparison of testing results by different methods (mg·kg-1)

数据统计结果（表10）显示：在7个因素中，样品进样量影响排在首位，在检测中应当注意这个因素，严格规定其检测条件。

表8 耐用性试验因素Tab.8 The factors in the ruggedness test

表9 耐用性试验组合Tab.9 Combination of the ruggedness test

表10 耐用性试验结果统计Tab.10 The results of the ruggedness tests

3 结论

通过对实验条件的优化，建立了UPLC-MS/MS同时测定电子烟烟液中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜和纽甜5种人工合成甜味剂的方法。在最优化的实验条件下，5种人工合成甜味剂的回收率在92.5%～105.2%之间，相对标准偏差在3.0%～4.5%之间。该方法以超纯水作为提取溶剂，绿色环保，定量结果准确可靠，前处理过程简单快速、分析时间短，能满足实验室的日常检测需要。