有机物料对植烟土壤养分、酶活性和微生物群落功能多样性的影响

张璐，阎海涛，任天宝, ，李帅，杨永锋，彭桂新，于建春，刘国顺,

1 河南农业大学，烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；

2 河南省生物炭工程技术研究中心，郑州 450002；

3 河南中烟工业有限责任公司，郑州 450000

近年来，烟叶生产中由于过量施用化肥，造成植烟土壤养分供应失调[1]，不利于土壤碳含量的增加[2]，导致微生物群落多样性降低[3]，严重影响着烤烟质量的提高。土壤微生物是土壤有机质和养分转化、循环的动力[4]，参与有机质分解、腐殖质形成，并调控土壤中能量和养分循环等过程[5]。保障烟田土壤养分协调和微生态环境健康，是生产优质烤烟的基础。施用有机物料调控土壤微生物群落代谢功能和结构，改善土壤质量，已成为切实有效的农业管理措施。

目前，关于土壤微生物的研究方法已有大量报道[6]，其中BIOLOG-ECO培养技术是一种采用微生物对不同碳源利用情况来表征其群落多样性的研究方法，能够快捷简便地得到分析结果。目前研究多集中于其他作物领域[7]，或是有机肥料对连作植烟土壤微生物功能多样性的影响[8-9]。慕平[10]研究表明作物秸秆还田能够显著增加土壤微生物碳源供给；顾美英[11]研究发现棉杆生物炭能够显著提高根际土壤微生物多样性，并改变土壤细菌群落结构；张逸飞[12]发现秸秆还田能够提高土壤微生物群落物种均一性；乔洁[13]认为草炭与氮肥配施显著提高了土壤微生物量碳、氮，有利于改善土壤结构和自我修复能力。此外，蒸汽爆破是利用蒸汽瞬间释放的压力以破坏物质结构的处理措施[14]，在农业领域作为有机物料改良植烟土壤效应的研究仍鲜见报道。因此，本试验研究了生物炭、草炭和蒸汽爆破秸秆物料以相同施碳量施入土壤后对土壤速效养分及微生物功能多样性的影响，以期探讨不同有机物料对土壤的改良效应，为有机物料还田改土提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验概况

试验于2017年5—10月在河南省登封市颍阳镇进行，海拔447 m，属暖温带大陆性季风气候，年平均温度15 ℃，≥0 ℃积温5178.8 ℃，年平均降雨量614 mm，无霜期238 d。

供试土壤为壤质潮土，其基本理化性质为：有机碳6.67 g/kg，总氮1.35 g/kg，碱解氮51.8 mg/kg，速效磷14.3 mg/kg，速效钾109.8 mg/kg，pH 7.12。试验用土取自大田耕作层表土，风干过筛，除去石子和植物残体。将风干后的有机物料和化肥、土壤混匀后装盆，每盆装土25 kg，肥料用量为氮素6 g/盆，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）＝1∶1∶3，N、P、K肥分别为分析纯硝酸铵（N 质量分数35 %）、磷酸二氢钾（P2O5质量分数22.8 %）、硫酸钾（K2O 质量分数50 %），70 %硝酸铵、全部磷酸二氢钾和40 %硫酸钾做基肥，剩余在移栽后20 d做追肥随水施入。烤烟品种为豫烟6号，5月2日移栽，其他管理按照当地常规栽培方式进行。有机物料成分见表1。

表1 供试有机物料的主要化学特性Tab.1 Nutrients content of tested organic fertilizers

1.2 试验设计

采用盆栽试验，共设5个处理：单施化肥（CK）；化肥+草炭（T1）；化肥+花生壳生物炭（T2）；化肥+汽爆烟梗（T3）；化肥+汽爆玉米秸秆（T4）。汽爆物料制取工艺：采用鹤壁市正道生物能源公司QBS-200B汽爆工艺试验台，将烟梗或玉米秸秆粉碎5～7 cm，在蒸汽压力2.0±0.1 MPa的条件下保持约5 min后进行瞬时爆破，干燥后粉碎。除CK外，按总碳量一致的原则施用各有机物料，每盆总碳施用量为0.35 kg。各处理具体物料用量如表2所示。每个处理20个重复，按照行株距130 cm×70 cm放置盆栽，大田整地起垄后将盆埋入土中，避免高温阳光直射以保水降温。各处理盆钵按照随机区组排列。盆底放置碎瓷片防止烟株根系伸出盆外。

表2 试验施肥设计 Tab.2 The experiment design of fertilization treatments

1.3 样品采集及处理

于烤烟移栽后90 d，每个处理选代表性烤烟3株，每盆取10 cm以下相同土层的3个不同部位的鲜土约200 g，去除石砾和植物残体，混匀过10目筛后一部分保存于4 ℃冰箱中用于土壤微生物量碳、氮和微生物群落功能多样性测定，一部分风干过40目筛用于测定土壤酶活性、有机碳、碱解氮、速效磷、速效钾和pH。

1.4 测定方法

土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量用常规方法测定[15]；pH值采用pH计测定，土水比1∶2.5；有机碳（SOC）采用重铬酸钾外加热法测定[15]；全氮（TN）采用全自动CN元素分析仪测定（型号：vario MACRO CNS）；可溶性有机碳（DOC）采用蒸馏水提取，岛津TOC-VCPH仪测定；蔗糖酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸比色法[16]测定；脲酶活性采用比色法[16]测定；土壤微生物量碳（SMBC）、氮（SMBN）采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法[17-18]测定；土壤微生物熵（qMB）取SMBC与SOC的比值。

土壤微生物群落功能多样性采用96孔BIOLOG ECO板进行检测，每一测试板内有96个小孔，其中含有3个重复的系列，每个系列中包含1个空白对照（水）和31种碳源。根据微生物利用碳源引起指示剂的变化检测和判断不同的微生物群落结构，接种后28℃下恒温培养7 d，每隔24 h用BIOLOG自动读板仪在590 nm下读数。上述操作均在无菌条件下进行。

1.5 数据处理

土壤微生物活性测定结果以烘干土重为基础（105℃，24 h）。微生物对碳源的利用采用微平板每孔颜色平均变化率（Average well color development，AWCD）描述，其中数值小于0的按0处理。应用Shannon、Simpson和McIntosh这3个多样性指数计算培养72 h时的土壤微生物碳源利用的多样性，其中在计算Simpson指数时，数据扩大1000倍以防止出现负数[19]。采用Excel 2013和SPSS 22.0软件进行数据处理和统计分析，采用Origin 8.0进行绘图。

表3 不同有机物料对土壤养分含量和pH的影响Tab.3 Effects of different organic fertilizer on soil nutrients content and pH value

2 结果与分析

2.1 不同有机物料对土壤速效养分和pH的影响

从表3可见，施用有机物料可以显著提高土壤碱解氮（AN）、速效磷（AP）和速效钾（AK）含量。T3和T4处理AN含量显著高于其他处理，比CK分别提高74.68 %和82.20 %。T3处理AP和AK含量在各处理中最高，与CK相比分别增加185.32 %和147.51 %，其次为T4处理。T1和T2处理AN和AP含量增加幅度小于T3和T4处理，但T2对土壤AK的提升效果好于T1。不同处理对土壤pH值影响不一致，除T2处理提高了土壤pH之外，其他处理都有一定程度降低。

2.2 不同有机物料对土壤碳、氮组分和微生物量的影响

由表4可知，施用有机物料可显著提高SOC和TN含量，均以T4处理效果最好，比CK分别提高97.16 %和82.81 %；其次为T2和T3处理，且提高幅度显著高于T1处理。土壤DOC以T4处理提高最多，相比CK提高2.37 %，T1、T2和T3处理相比CK都有不同程度的下降且达到显著水平，分别降低18.86 %、42.75 %和16.76 %。施用有机物料对土壤微生物量碳也有显著提高作用，处理间效果具有显著差异；其中均以T4处理效果最好，其微生物量碳、氮含量均处于最高水平，分别较对照提高177.96 %和120.96 %，T1处理对SMBC有显著提高作用，但对SMBN促进作用不显著。从土壤微生物熵qMB来看，T1、T3和T4处理均表现出促进作用，其中T3和T4处理达到显著水平，但T2处理显著降低了qMB，相比CK下降11.22 %。

表4 不同有机物料对土壤碳、氮组分和微生物量的影响Tab.4 Effects of different organic fertilizers on soil carbon and nitrogen fractions and microbial biomass

2.3 不同有机物料对土壤酶活性的影响

从图1可见，T2、T3和T4处理蔗糖酶活性相比CK有显著提高，且T3和T4处理均高于T2处理，分别比CK提高88.74 %和91.23 %。T1处理蔗糖酶活性与CK相比无明显差异。土壤脲酶活性以T4处理最高，且显著高于其他处理，相比CK增加了124.42 %；T2和T3处理次之，且显著高于T1处理。从土壤酶活性来看，T4处理效果最好，T1处理下土壤酶活性与CK对比无明显改变。

图1 不同有机物料施用对土壤酶活性的影响Fig.1 Effects of different organic fertilizers on soil enzyme activities

2.4 不同处理土壤微生物的代谢功能分析

图2 不同有机物料处理平均颜色变化率（AWCD）变化Fig.2 Variations of average well color development (AWCD) for different organic fertilizer treatments

图3 不同处理有机物料处理土壤微生物对6类碳源的利用情况Fig.3 Relative absorbance of the six kinds of carbon sources by soil microorganism treated with different organic fertlizers

2.4.1 不同有机物料施用下土壤微生物碳源利用情况各处理土壤微生物碳源利用的平均颜色变化率（AWCD）如图2所示。不同处理的AWCD有差异且上升速度不同，并且这种差异随着时间的延长逐渐加大。与CK相比，各处理AWCD都有提高，说明施用有机物料能够提高土壤微生物对底物碳源的利用能力，其中T2、T3和T4处理微生物利用碳源能力无明显差异，但都明显高于T1和CK处理。从不同处理土壤微生物对6类碳源的相对利用率分析看（图3），T1处理对氨基酸类碳源的相对利用率最高，T2处理主要利用羧酸类和多聚物类的碳源，T3处理土壤微生物对酚酸类碳源的利用最多，T4处理利用最多的为碳水化合物类碳源；CK处理单施化肥条件下，对多聚物类碳源的利用率显著低于其他处理。

2.4.2 不同有机物料施用下土壤微生物利用碳源的主成分分析

BIOLOG的主成分分析能够解释不同处理土壤微生物碳源利用的差异。BIOLOG ECO平板中31种碳源分为6大类（表5）。利用培养72 h后的BIOLOG比色结果进行主成分分析，结果表明PC1和PC2分别可以解释所用变量方差的64.86 %和20.48 %（图4）。根据分析结果将6类碳源分为2大类，由表5可知PC1包含的碳源有4类，分别是碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类和胺类；PC2中包含的碳源有2类，分别是羧酸类和多聚物类。

进一步分析表明（图4），各处理之间有明显的空间分异，T2处理所对应的投影点主要分布于PC2轴的正端，说明该处理土壤中的土壤微生物主要利用PC2轴所荷载的碳源（羧酸类和多聚物类）；T4处理投影点主要分布于PC1轴正端，说明该处理土壤微生物主要利用PC1轴所荷载的碳源（碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类和胺类）；T1和T3处理投影点主要分布于PC1和PC2轴的负端。

表5 元件荷载矩阵Tab.5 Component matrix

图4 不同处理土壤微生物碳源利用特性的主成分分析Fig.4 PCA analysis of carbon utilization for microbial communities in soil treated by different organic fertilizers

2.4.3 不同有机物料施用下土壤微生物代谢功能多样性分析

Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数分别代表了微生物群落的丰富度、最常见种的优势度和物种的均匀度。从表6可以看出，土壤微生物的Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数在各处理之间差异显著（P＜0.05）。与对照相比，不同有机物料处理均能够提高土壤微生物丰富度，以T2和T4处理较高，T1和T3处理次之。T2、T3和T4处理土壤微生物优势度指数均显著高于对照，T1与对照差异不显著。各处理均匀度指数与对照相比均有显著提高，但4个施有机物料的处理间差异不明显。

表6 不同处理的土壤微生物代谢功能多样性指数Tab.6 Diversity indexes of soil microbial community metabolic function under different organic fertilizer treatments

3 讨论

3.1 不同有机物料施用对土壤碳、氮组分及速效养分的影响

本研究中，施用有机物料显著提高了土壤SOC和TN含量，这与李新华[20]和陈源泉[21]研究结果一致。草炭富含腐殖酸和有机质[13]，生物炭含碳量丰富[22]、汽爆烟梗和玉米秸秆含有大量纤维素和木质素[23-24]，在土壤微生物分解下进入土壤，在相同总碳含量条件下，物料组分不同可能造成在土壤中的代谢快慢和产物有所差异，但都提高了土壤有机碳含量。张杰[25]研究表明，等碳量条件下施用秸秆和木质素能显著增加土壤DOC含量，施用生物炭处理较对照无显著差异，高学振[26]研究发现，添加生物炭对砂姜黑土DOC影响不显著， 本实验条件下生物炭处理DOC含量与对照相比未达到显著差异，可能与生物炭能减少土壤DOC淋失[27]有关，需设置实验做进一步探讨。此外，王允青[28]研究表明秸秆还田后会释放养分，以磷释放率最大，与本试验中施用有机物料提高了土壤养分含量的结果一致。一方面由于有机物料多为植物残体，富含化学能和矿质养分，在田间腐解过程中释放养分，提高土壤肥力；另一方面，有机物料也为土壤微生物繁殖提供了生存能源，提高了与养分代谢有关的微生物群落的丰度和活力，有关研究[29-30]发现有机肥能够提高土壤反硝化菌种群落和根际土壤解磷菌活力，从而促进土壤养分的代谢和转化。

3.2 不同有机物料施用对微生物生物量和土壤酶活性的影响

有机物料的施入能够向土壤输入较多的有机碳源，为微生物提供所需营养，促进微生物繁殖，提高土壤微生物生物量。本研究中有机物料的施用也起到了提高土壤微生物生物量碳、氮和微生物熵的作用。生物炭比表面积大，孔隙多，能够为土壤微生物的附着提供场所[31]，能够吸附和储存土壤养分，从侧面促进土壤微生物的繁殖，因此土壤微生物量相比对照有显著提高；但由于生物炭成分结构相对另外3种有机物料而言较为稳定，不易被微生物利用。因此，本试验中生物炭处理微生物熵显著低于汽爆烟梗和玉米秸秆处理。草炭含有丰富的有机质，可为微生物提供丰富的活动能源，但草炭处理微生物量氮显著低于其他有机物料处理，可能是因为草炭中的腐殖酸对脲酶有抑制作用，影响土壤氮素转化，减少了微生物可利用氮素含量。蒸汽爆破处理后的作物秸秆面积增大，有利于微生物的栖息和分解有机物，因此施用烟梗和玉米秸秆处理的微生物量和微生物熵均显著高于其他处理。

脲酶在一定程度上反映了土壤供氮水平的高低[32]，蔗糖酶参与土壤中的蔗糖转化为葡萄糖和果糖的过程，在碳循环中有重要作用。本研究中施用有机物料提高了土壤微生物量，可能是土壤微生物的增加为促进含有土壤酶分泌物的产生创造条件，显著提高了土壤脲酶和蔗糖酶活性，有利于加快有机物料在土壤中的分解转化[33-35]。

3.3 不同有机物料施用对土壤微生物代谢功能多样性影响

AWCD值反映了土壤微生物利用碳源的能力[36]，本研究中与对照相比除草炭外的各处理利用碳源的能力都有所提高，有机物料使用条件下微生物常见物种优势度和物种均匀度均优于对照。另外，同一种有机物料处理下微生物群落对不同碳源的相对利用率存在明显差异，原因可能是材料本身组分差异。许文欢[37]认为生物炭的施用促进了以多聚物类为碳源微生物群落的生长，但未改变碳源利用多样性。本研究结果表明，生物炭有利于以羧酸类和多聚物类为底物的微生物生长，与其研究结果一致；然而不同的是在本试验中，生物炭处理在主成分分析中与其他处理明显区别开来，可能是生物炭促进一些微生物种群繁殖的同时，会抑制另一些微生物种群的繁殖，对丰富度和均一度造成一定影响[38-39]。本试验条件下土壤微生物功能多样性被改变，可能与土壤质地和生物炭用量及种类有关，需进一步试验探究。

4 结论

施用有机物料促进了土壤有机碳含量、微生物生物量的提高和土壤酶活性增强，改善了土壤养分状况，使土壤微生物碳源利用能力得到增强，提高了微生物群落功能多样性。生物、炭促进了以羧酸类和多聚物类为碳源的微生物的生长，汽爆玉米秸秆促进了以碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类和胺类为碳源的微生物的生长。总之，有机物料为土壤微生物提供了丰富的碳源和生长物质，促进利用不同种类碳源的微生物生长，提高了土壤微生物对有机物料的转化，对土壤改良具有积极效应。