利用HRM技术鉴定db/db小鼠基因型方法的建立

2019-05-18谭睿陟刘彤彤张宇韦

西南医科大学学报 2019年2期

林晓，谭睿陟，刘彤彤，张宇韦，王丽

（西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 646000）

随着我国生活水平不断提高，糖尿病等慢性代谢疾病的发病率呈直线上升趋势[1]，严重威胁到人类健康，已成为较大的医疗负担[2]。

db/db小鼠为美国Jackson实验室研发，该小鼠4号染色体的瘦素受体等位基因突变形成了自发性的糖尿病。db/db小鼠没有繁殖能力，将杂合子db/m与db/m进行交配，繁殖的后代有三种表型：1/4的野生型m/m，1/2的杂合子db/m,1/4的纯合子db/db。db/m和m/m在体型上相似，它们的血糖、体重、血浆都正常。但是由于m基因对代谢影响较大，所以m/m与db/m相比，代谢效率更高，更容易耐受饥饿。而db/db在2周龄左右即出现高胰岛素血症，3到4周龄明显肥胖，4到8周龄出现高糖血症，并表现出多食，消渴，多尿等典型糖尿病的临床表现，其肾脏，心血管，末梢神经等多个系统可观察到病理变化，在研究糖尿病发病机制及治疗方面具有较高的应用价值[3-4]。HRM（high resolution melting），即“高分辨率熔解曲线”，是最近在国内外兴起的最新SNP及突变研究工具，具有简单、快速、高通量、低成本的特点，可用于突变扫描，基因分型和甲基化研究。该技术在标准qPCR试剂的基础上再加入饱和双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。由于纯合db/db小鼠基因型鉴定困难，常用的小鼠基因型鉴定方法酶切法和DNA测序法费时费力，成本相对较高。本文采用HRM技术建立了对db/db小鼠基因型鉴定的方法，并对其结果的准确性和一致性进行了验证[4-5]，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

db/db小鼠（BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J，Jax编号：000642）购于Jax Lab。于SPF级实验动物中心常规饲养，在饲养期间每日给予小鼠足够的SPF级饲料和新鲜的饮用水，室温20～22℃，相对湿度60%～70%，光照12 h明暗交替。在出生3周左右剪取鼠尾提取DNA，利用HRM技术鉴别野生型（m/m），杂合子（db/m），纯合子（db/db）[6]。

1.1.2 实验试剂

2×Super EvaGreenMaster Mix for HRM试剂盒购于US Everbright；DNA提取试剂：SDS购于上海伯乐生命医学产品有限公司，Tris、EDTA购于上海生工工程股份有限公司，蛋白酶K购于上海艾研生物科技有限公司；酶切试剂：Taq polymerase购于北京全式金生物技术有限公司，dNTP、AfaI、0.1%BSA、10×buffer购于Takara。

1.1.3 实验仪器

主要仪器LightCycler®480 II实时荧光定量PCR仪，MSC-100ThermoShakerIncubator，Nano-Drop2000 Spectrophotometer，BIO-RAD PowerPac Basic电泳仪及电泳槽，Veriti™96-Well Thermal Cycler。

1.2 方法

1.2.1 模型小鼠DNA提取

酚氯仿提取法:剪取0.3～0.5 cm小鼠尾巴，放入1.5 mL EP管；加入190 μL裂解液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），55℃，750 r/min过夜震荡，使之充分消化；加入10 μL RNA酶(20 mg/mL)，混匀，37 ℃恒温箱中放置1 h后13 000 r/min离心5 min,取上清到新的1.5 mL EP管中；加入等体积（200 μL）的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，反复颠倒 20次后室温放置5 min；4℃下13 000 r/min离心5 min，转移上层水相（约200 μL）至一新的1.5 mL EP管中；加入等体积(200 μL)异丙醇沉淀DNA,反复颠倒离心管20次，13000 r/min，15 min收集沉淀的DNA；小心倾倒出异丙醇。将DNA沉淀浸没于1 mL 70%乙醇里。如果沉淀比较松散，再离心5 min。倾倒除去乙醇，开盖在室温下放置15～20 min或在37℃孵育箱中放置5 min，让乙醇充分挥发（此步骤重复两次）；加入50 μL ddH2O，轻微震荡使DNA沉淀溶解，-20℃保存备用。

改良后的DNA提取方法:剪取小鼠尾端约0.5～1 cm，放入1.5 mL EP管中；每管加0.5 mL裂解液[0.5%SDS，0.05 M Tris-HCL(pH 8.0),2.5 mM EDTA，0.1 M Nacl]和 50μl蛋白酶 K(100 μg/mL)[7]，55 ℃震荡过夜；第2 d将样本，12 000 r/min，4℃，离心 10 min；收集上清加入1.5 mL EP管中，加1 mL100%乙醇，盖紧盖子后轻摇，可见絮状沉淀；13 000 r/min，离心15 min，弃上清；加70%乙醇1 ml，洗涤，13000 r/min，离心10～15 min；弃上清，收集沉淀，室温放置10～15 min；每管加100 μL ddH2O，盖好后在室温放置1 h或数小时使之充分溶解；待DNA全部溶解后-20℃保存（如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30～60 min，但不可过夜）。

1.2.2 引物的设计与合成：

根据Geenbank中Lepr基因序列（NC_000070），设计用于PCR扩增的引物，见表1、表2。

表1 用于HRM的正向和反向引物

表2 用于DNA测序的正向和反向引物

1.2.3 反应体系及条件

PCR扩增及HRM分型：PCR扩增及HRM分型在LightCycler®480 II实时荧光定量PCR仪上完成，使用包含一种专为qPCR和高分辨溶解曲线分析设计的DNA结合染料的2×Super EvaGreen Master Mix for HRM试剂盒（US Everbright Inc.），在PCR仪上运行Gene Scanning选项对PCR扩增产物进行分析。最初的反应体系：2 × Mix for HRM 10 μL；primer hrm F+R 1 μL；DNA模板（10 ng/uL），1 μL；ddH2O8 uL；优化后的反应体系：2× Mix for HRM 5 uL；primer hrm F+R 1.5 uL；DNA模板（5 ng/μL）1 μL；dd H2O 2.5 μL。最适反应条件：pre-incubation，95 ℃ 2 min；amplication，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45个循环；HRM，95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；cooling 1 h。

测序法：PCR扩增体系10 × buffer 2 μL；PrimerF 0.5 μL；PrimerR 0.5 μL；dNTP 1 μL；Taq polymerase 0.2 μL；ddH2O 14.8 μL；DNA 1 μL；然后在PCR仪直接运行“Genotyping”程序（stage 1：95℃ 5 min；stage 2：95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，35个循环；stage 3：68℃ 10 min，16℃ ∞。）PCR完成后，用1%的胶点样2 μL检测是否有条带，将有条带的阳性样本送上海生物工程有限公司测序。

1.2.4 血糖测定

糖尿病小鼠会出现糖代谢紊乱，所以在小鼠空腹12 h后，抽取尾尖静脉血测定其血糖含量，从出生后第8周龄开始，每隔一周检测一次，持续一个月，观察三种基因型小鼠的血糖变化趋势。

1.2.5 数据统计

数据结果采用SPSS 17.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s），多个样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较用LSD法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 改良DNA提取方法与常规方法的结果

对所提取的DNA测定其在260 nm和280 nm处的吸光度值，通过A260/A280的比值判定DNA的纯度。检测结果显示，用常规方法提取的DNA其A260/A280比值多数小于1.8，提示可能存在蛋白质污染；而改良方法提取的DNA其A260/A280比值多为1.8～2.0，纯度较高，说明改良DNA提取方法比常规方法更优。

2.2 利用HRM技术进行基因鉴定的三种分型结果

由于野生型，纯合子，杂合子三种基因型具有不同的核酸序列，溶解曲线有所差异，据此可以分辨出三种基因型。在所设计的反应条件下对样品进行鉴定，能够准确区分出野生型（m/m），纯合子(db/m)，杂合子(db/db)，见图1。

2.3 HRM反应条件优化结果

图1 利用高分辨溶解曲线（HRM)分析技术对db/db小鼠的基因分型结果

本实验设计了三种不同退火温度，分别是58℃、62℃、65℃，最后的结果表明当退火温度为58℃时更能准确地区分出三种基因型的熔解曲线。通过对退火温度的优化，找到最适反应条件，提高了分型准确性。当所用DNA模板浓度和其他试剂用量减半，也能获得良好的分型结果，在很大程度上节约了实验成本。

2.4HRM分型结果与DNA测序法结果一致

将用qPCR-HRM已经分型的三种基因型样品，再用DNA测序方法进行验证。结果显示HRM分型结果与DNA测序法分型结果一致，证明HRM分型结果的准确性(见图2）。

2.5 HRM分型结果与小鼠表型一致

图2 db/db小鼠的DNA测序分型结果

小鼠在出生三周左右就被减尾鉴定基因型，在剪去尾后继续饲养观察。在出生2～3个月后，与野生型和杂合子相比，db/db小鼠多饮，多食，多尿症状明显，体重大幅度上升，差异具有统计学意义（F=1015，P＜0.000 1）。测定空腹状态下db/db小鼠的血糖，可高达20 mmol/L，耐受糖的能力明显下降。表明HRM分型结果是准确的，小鼠表型符合预期结果(见图3）。

图3 通过HRM鉴定的三种基因型小鼠的表型

3 讨论

糖尿病在我国乃至全世界其发病率均呈逐年上升趋势，已经成为全世界致死率极高的疾病之一。因其病因复杂，与多种因素相关，在研究和治疗糖尿病方面还有诸多问题亟待解决。与以往用的ob/ob小鼠相比，db/db小鼠糖尿病的发病进程与人类T2DM相似，病程长，病情稳定，“三多一少”合并肥胖症状明显，是现在应用较为广泛的一种糖尿病模型。而对于只是发生点突变的糖尿病小鼠模型的基因检测，采用常规的基因测序和酶切法普遍存在耗时长，过程复杂，难以实现高通量需求等问题。HRM技术是近几年兴起的一种检测技术，通过PCR扩增产物的溶解曲线，能分析检测出基因序列之间的微小差异[8-9]。本实验利用HRM技术建立了db/db小鼠的基因分型方法，减少了DNA提取样品和试剂的消耗，并且通过对退火温度的优化，使其准确度和稳定性更高。该方法省时省力、交叉污染小、结果准确度高，在批量进行db/db小鼠基因鉴定上值得大力推广。

3.1 改良DNA提取方法，获得纯度较高的DNA产物

与以往的DNA提取方法相比，本实验采用了改良后的DNA提取法。因酚保存时间短，容易造成DNA产量降低和DNA碎片，从而会影响后面的基因分型结果[7]。而改良后的方法操作简便，大大减少了交叉污染的几率，并且能够得到高纯度的DNA，提高基因分型的准确性，适用于提取大量样品。

3.2 优化后的HRM方法鉴定db/db小鼠省时省力，准确度高

随着对基因领域研究的不断深入，传统的测序和酶切方法操作繁琐，耗时长，而近几年兴起的HRM技术能够具有高通量，快速，准确度高，稳定性好的特点[10]。在临床研究，疾病诊断方面受到了很多科学家的赏识。另外，Gene Scan是一种用途十分广泛的DNA片段分析技术，是将荧光标记的DNA片段，如PCR产物，在测序仪上对其进行片段大小、拷贝数量分析检测的过程。用HRM方法分析样品时，需要用到Gene Scan对PCR扩增产物进行数据分析，以保证结果的准确性[11-12]。

本文以db/db小鼠为例，建立了qPCR-HRM基因分型方法，分型结果与DNA测序法结果高度一致，且分型结果与小鼠表型所体现出来的疾病状态一致，说明该方法鉴定db/db小鼠基因型的可靠性。通过对HRM反应退火温度进行优化，找到了最适的退火温度，能够更加准确清楚的分辨出三种基因型的熔解曲线。在减少了DNA模板的浓度和反应体系的体积之后，PCR扩增依然能达到平台期，没有发生非特异性扩增，效果好，在一定程度上减少了消耗。与DNA测序法相比，大大缩短了实验时间，操作简便，省时省力。整个扩增过程中为闭管操作，污染小，同时一次可分析大量样品，可用于大批样本的检测。