CK18在乳腺癌血清中的表达与临床意义

张 青 ，黄 钱，刘晓燕 ，甘 淋

（西南医科大学：1基础医学院生物化学与分子生物学教研室，2附属医院乳腺外科，3医学基础研究中心，四川泸州 646000）

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，近年来其发病率呈逐年上升的趋势并呈现年轻化，严重威胁着女性的身心健康[1]。乳腺癌的复发和转移是导致其死亡的主要原因，也是临床治疗的难点和重点[2-3]。近年来，虽然对乳腺癌发生和发展的分子机制研究逐年深入，但其具体的发病机制仍然是不清楚的，同时也缺乏高效特异的肿瘤诊断标志物。寻找乳腺癌患者术后复发、远处转移、评估疗效及预后的早期诊疗分子标志物，其最终目的是要降低乳腺癌人群的死亡率[4]。

细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是细胞骨架的中间丝蛋白家族中最大、最复杂的亚类，它不仅维持上皮细胞及组织的稳定性和完整性，同时还参与了细胞内的信号转导通路，与细胞的分裂、运动以及分化、凋亡等过程直接相关[5]。研究发现，细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)在肺癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等表达显著异常，并且与多种肿瘤的转移、病情进展以及预后直接相关[6]。本研究通过对比健康人和乳腺癌患者血清中CK18的表达情况，以探讨其表达异常能否在乳腺癌的筛查、诊断、肿瘤监测及预后评估等方面提供一种更好地选择，为其治疗提供新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2016年9～12月西南医科大学附属医院乳腺外科乳腺癌患者外周血26例，并经病理证实；26例健康人血清来自健康体检中心。本研究经医院理委员会批准，且研究对象均知情，并签署知情同意书。

纳入标准：①所有研究对象均为女性，年龄、性别以及体重等病例资料完整；②患者入院采集血液时未经放疗、化疗或者手术治疗；所有病例经病理诊断证实为乳腺癌。

排除指标：①妊娠、哺乳期患者；②乳腺癌术后病理分期、分子分型不明确者；③合并胃癌、结直肠癌等消化系统或其他恶性肿瘤的乳腺癌患者；④乳腺癌患者在采集外周血前1周内有药物服用史；⑤健康人纳入前1年内有手术治疗病史或有既往肿瘤病史；⑥患者不同意加入实验。

1.2 标本采集

病理标本均为晨起空腹时采集血液标本，于取样30 min内置于4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装后冻存于-80℃备用。

1.3 主要的实验试剂及仪器

CK18一抗购自Bioworld生物科技有限公司；二抗购自CST公司山羊抗兔；电泳仪、转移电泳仪槽均购自美国Bio-Rad公司；低温离心机购自Thermo Fisher公司；酶标仪购自BioTek公司；扫描仪购自基因有限公司

1.4 染色方法和结果判定

免疫组织化学严格按照Envision两步法标准流程进行操作，按照WHO乳腺肿瘤组织学分类（2012）[7]，结合2015年St.Gallen共识[8]进行诊断。ER、PR阳性的判断标准为：≥1%的肿瘤细胞出现细胞核阳性。HER-2为膜着色，不着色为HER-2（-）；阳性细胞数＞10%，着色弱且不连续为HER-2（1+），着色中等且部分不连续为HER-2（2+），着色强且连续为HER-2（3+）；本研究中将HER-2（-/1+/2+）判为阴性，HER-2（3+）判为阳性或过表达。

1.5 实验方法

乳腺癌及健康人的血清标本采用蛋白质免疫印迹（western blot，WB）检测，将血清标本于4℃过夜解冻，4℃，12 000 r/min离心60 min，去除高丰度蛋白。10%SDS-PAGE凝胶分离，上样50μg总蛋白，PVDF膜100V转膜1 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，CK18抗体（1∶500）及GAPDH（1∶10 000）室温2.5 h后4 ℃过夜；洗膜3次，每次10 min，加入二抗；荧光显影，并采集蛋白条带图像，用ipp6软件分析相对灰度值。

1.6 统计方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，用百分比描述病理学资料，计量资料用均数±标准差（±s），两个样本均数比较用t检验，计数资料比较用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 健康人和乳腺癌患者血清中CK18含量比较

采用WB检测26例乳腺癌患者和26例健康人血清中CK18表达，结果显示：在26例乳腺癌患者血清中，CK18阳性表达19例，阳性率73%；在健康人血清中，CK18阳性表达25例，阳性率96%（图1）。分析CK18阳性的乳腺癌患者与健康人血清中CK18/GAPDH相对灰度值，发现：健康人组CK18/GAPDH相对灰度值为（0.11±0.06），乳腺癌患者组CK18/GAPDH相对灰度值为（0.24±0.10）（图2）。对两组的相对灰度值进行统计学分析，提示CK18在乳腺癌患者血清中表达增高，差异具有统计学意义（t=2.458，P=0.039）。

图1 WB检测CK18在血清中表达情况

2.2 临床病理学特征比较

对CK18在乳腺癌患者血清中表达与临床病理学特征的相关性进行比较,其中CK18阳性表达乳腺癌患者的中位发病年龄较CK18阴性表达乳腺癌患者高，分别为（46±6.30）岁和（45±12.76）岁；肿块平均直径在2.5 cm左右，同时伴有淋巴结转移均在50%以上；两者病理类型主要以浸润性导管癌为主，为90%左右，WHO分级主要为Ⅱ级；免疫组化显示：ER、PR、HER-2均为阳性占90%左右。结果显示，CK18在乳腺癌患者血清中表达情况在上述各种因素中均无统计学差异，两者之间差异均无统计学差异（P＞0.05）。

图2 两组血清中CK18和GAPDH相对灰度值比较

表1 乳腺癌患者血清中CK18阳性表达和CK18阴性表达临床病理学特征比较

3 讨论

目前，乳腺癌已经成为全球女性最高发的恶性肿瘤。研究发现，2018年美国乳腺癌患者发病率和死亡率较以往仍持续升高[9]。据文献报道，在我国乳腺癌现已位居女性各类癌症发病率之首[10]。故寻找乳腺癌早期诊断和评估预后的特异性分子标志物已成为研究热点。细胞角蛋白18存在于上皮细胞的胞质中，参与调节细胞的重要信号转导途径，例如细胞周期、凋亡以及癌症进展。目前有许多研究表明，CK18在许多肿瘤疾病中异常表达，其中包括呼吸系统、消化系统、泌尿系统及妇科等多个系统的肿瘤。CK18是肝细胞中重要的中间丝蛋白，已被确认为各种肝炎进展的潜在标志物。一项Meta分析发现，与健康人血清相比，肝炎患者血清中CK18表达水平明显升高，可能与与肝纤维化加重，肝细胞凋亡和严重肝损伤有关，并且表明血清中CK18表达在检测肝损伤方面具有重要的价值[11]。Ismail等[12]通过检测30名肝硬化患者和30名肝癌患者血清中CK18的表达，发现肝癌患者血清中CK18表达明显升高，并且灵敏度高于临床常用的血清甲胎蛋白（AFP）的测定，并且CK18和AFP联合检测的灵敏度高达98%，CK18有望成为肝癌患者新的分子生物诊断标志物。De等[13]通过观察179例非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者、113例肺部良性疾病患者和200例健康人的血清后发现NSCLC患者血清中CK18表达明显高于良性组和健康组，对NSCLC的预后评估具有重要的意义。

国内外相继报道了CK18与不同系统肿瘤之间的研究，但与乳腺癌的研究报道并不多，而且既往的研究主要集中在癌组织、癌旁组织中CK18表达情况，CK18与乳腺癌患者血清的报道甚少。Bozza等[14]发现在下调乳腺癌细胞系（T47D，BT474和MCF7）角蛋白8基因的表达，随着K8/K18蛋白表达的缺失，DR5蛋白表达水平显著增加，并增加了TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性，表明K8/K18蛋白的过表达保护乳腺癌细胞系免受TRAIL诱导的细胞凋亡。Yang等[15]评估了乳腺癌中CK18过表达与ER、PR和HER2之间的关系，发现CK18高表达与PR和HER2阳性表达显著相关，与ER阳性表达无明显关系，并且高表达的CK18与肿瘤大小（≥2 cm）、年龄（≥50岁）以及乳腺癌疾病的进展呈正相关。Zhang等[16]发现将人肺癌H1975和Calu-3细胞的CK18敲低后其运动和迁移能力明显减弱且CK18高表达的患者具有更差的总生存期和无病生存期(disease-free survival，DFS）。根据一项Meta分析显示，乳腺癌患者血清中CK18高表达与其总生存期（overall survival，OS）显著相关，其在血清中的高表达预示着乳腺癌预后不良[15]。

4 结 论

CK18在健康人和乳腺癌患者血清中均表达，但在乳腺癌患者血清中明显高于健康人。这与以往关于肿瘤包括乳腺癌、肝癌等的研究结论相一致，表明CK18是乳腺癌早期诊断、疗效、术后监测乳腺癌复发的潜在生物标志物。另外，在乳腺癌患者血清中CK18表达与年龄、肿瘤大小、WHO分级高低、病理类型、ER、PR、HER-2表达与否均无明显相关性。这与以往的结果不符，可能是因为本实验属于小样本资料，在统计分析上可能存在偏倚，需要后期大量的基础和临床研究进一步证明CK18在乳腺癌血清中的表达情况及和各临床因素的关系。