龙脑樟树叶内生真菌的分离及生物活性菌株的筛选鉴定

金宏杰 曹红 刘红 郑爽 姜超

（1. 石河子大学生命科学学院，石河子 832000；2. 嘉兴学院生物与化学工程学院，嘉兴 314000）

龙脑樟树是重要的药用樟，其枝叶精油富含右旋龙脑，因此是提取天然冰片的主要来源［1］。从药用植物中寻找天然产物由来已久，但由于其产率低且对生态环境的破坏较大，迫切需要从新的来源寻找具有生物活性的天然产物［2］。因为药用植物内生菌次生代谢产物含有与宿主植物相同或相似的活性成分［3］，目前关于内生菌次生代谢产物的研究越来越受重视。

内生真菌是长期寄生于植物组织而不产生明显症状的真菌［4］，同时也是天然药物筛选的巨大宝库。早在1904年就开始了对内生真菌的研究但是起初并不受重视，直到紫杉醇的发现才有所好转，并且在近几年来更是飞速发展［5］，越来越多的研究表明其活性产物具有抗癌、抑菌、抗氧化、神经保护、抗炎症反应等功效。Stierle等［6］从短叶紫衫的韧皮部中分离出一种新的内生真菌Taxomyces andreanae可产生紫杉醇和紫衫烷类化合物；Rehman等［7］从青脆枝种子中分离得到粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）能够产生抗癌药物喜树碱。Isaka等［8］从香蕉中分离得到内生真菌Botryosphaeriasp.BBC 8200能产生香豆素类抗癌物对多种癌细胞有较强的抑制活性。由此可见市面上很多的药物成分都可以在内生菌中发现分离。

龙脑樟树作为重要的药用植物，目前国内外关于它的研究主要集中在其产冰片和精油方面而很少关注于它的内生菌方向。Kharwar［9］对樟树的内生菌分布和抑菌活性进行了研究，发现叶片的中脉是内生菌最聚集的地方，同时对Phytophthora cryptogea等病原菌有较强的抑制作用；游玲［10］对78油樟的内生菌发挥性成分进行了研究，发现其成分主要是C10-C28的烷烃类，其他还有醇类、酯类等物质。本研究从龙脑樟树叶中分离得到内生真菌，并对其发酵产物的抑菌、抗氧化、抗肿瘤活性进行研究，希望从中筛选具有良好生物活性的菌株，并为下一步次生代谢产物的分离奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 新鲜龙脑樟树（Cinnamomum camphora）叶片采集于嘉兴神木龙香林业有限公司（E：120.6410°，N：30.7266°），选择一年生的生长状态良好且相似，没有腐烂或者病斑的叶片约20片，放于密封袋中保存。

1.1.2 细菌菌株 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）均保存于嘉兴学院微生物学研究室。

1.1.3 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7保存于嘉兴学院医学研究室。

1.1.4 培养基 NA培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl5 g、琼脂20 g、水1 000 mL。PDA培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL。察氏培养基：NaNO33 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、K2PHO41 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、水1 000 mL。

1.1.5 主要试剂和仪器 RPMI-1640培养基，上海浩然生物技术有限公司；MTT，DPPH，水杨酸，双氧水，抗坏血酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；药敏试纸，南京茂捷生物科技有限公司。恒温震荡摇床，上海智城仪器有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；酶标仪，美国Bio-Rad实验有限公司；倒置显微镜，上海光密仪器有限公司；恒温培养箱，上海恒一科学仪器有限公司；紫外分光光度计，澳大利亚GBC公司。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离 采用组织块法［11］对龙脑樟树叶片中的内生真菌进行分离。将新鲜叶片在自来水下冲2 h后晾干，剪取5 mm×5 mm的叶片样本放入50 mL离心管中准备表面消毒。75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次，2%次氯酸钠溶液浸泡3 min，75%乙醇浸泡1 min，无菌水洗3-5次。叶片阴干后接种于含250 μg/mL氯霉素的PDA和察氏培养基上，28℃培养7 d。取最后一次漂洗液涂布于培养基上作为漂洗对照，取已消毒的叶片与培养基接触20 min后取出作为组织对照，空白培养基作为环境对照。待样本周围长出菌丝后，用平板划线法接种于对应的培养基上于28℃进行纯化培养，直至形成单一菌落。

1.2.2 抑菌活性检测 将纯化完毕的菌株在PDB培养基中28℃，150 r/min液体发酵培养7 d后取3 mL发酵液于离心管中12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm无菌过滤器后4℃冰箱保存备用。

取在NA培养基上正常生长的4种细菌，用接种环挑取适量菌体，接种于装有10 mL无菌水的锥形瓶中，震荡均匀，调整菌悬液的浓度，使其含有的菌体的量在1×105-106个/mL。

根据Stefanakis等［12］的方法用K-B纸片法测抑菌圈直径并观察抑菌圈的透明程度，以10 μg/片的氨苄西林药敏纸片作为阳性对照，空白培养基作为阴性对照，每次实验3次重复，筛选出具有良好抑菌作用的菌株进行下一步实验。

1.2.3 抗肿瘤活性检测 菌株液体发酵方式同1.2.2。用MTT法［13］测定发酵液原液对MCF-7细胞株的抑制率，具体方法如下。取对数生长期的上述细胞用胰蛋白酶消化稀释成5×104个/mL，以每孔200 μL加入96孔板中，周围一圈加入PBS溶液防止蒸发。于37℃，5% CO2条件下在培养箱中培养24 h后以空白培养基为对照，每孔加入30 μL上述制备好的发酵液每个样品5个复孔作为重复，置于培养箱中继续培养，并于不同时间观察、拍照记录细胞生长及形态变化。最后发酵液处理48 h后加入20 μL MTT（5.0 mg/mL）继续培养4 h后弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪490 nm测定吸光度值。

清除率（%）=（1-对照组/实验组）×100%

1.2.4 抗氧化性检测

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力测定 DPPH自由基清除实验参照Concepcion等［14］的方法并略有改动。取上述制备好的发酵液2 mL加入80 μmol/L的DPPH溶液2 mL，摇匀后静至反应25 min，无水乙醇调零，在517 nm测其吸光度记为A1。用2 mL样品液和2 mL乙醇混合测其吸光度为A2，以无水乙醇代替样品液作为空白对照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作为阳性对照，同一样品3次平行对照。

清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%

1.2.4.2 羟自由基清除能力测定 羟基自由基清除能力测定参照Smirnoff等［15］方法并略有改动。取1 mL上述制备好的发酵液依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L水杨酸及1 mL 8.8 mmol/L的H2O2开始反应。37℃恒温水浴20 min后，测定510 nm处吸光度为A1。用蒸馏水替代水杨酸测吸光度为A2，以蒸馏水代替样品液作为空白对照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作为阳性对照，同一样品3次平行。

1.2.4.3 过氧化氢清除能力测定 过氧化氢清除能力测定参照Du等［16］报道的方法并略有改动。取4 mL上述发酵液，加入以pH 7.4的磷酸盐缓冲液配置的1%过氧化氢溶液1.0 mL，反应10 min后230 nm下测吸光度记为A1。用不加H2O2的反应液调零，以培养基代替样品液作为空白对照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作为阳性对照，同一样品3次平行。

清除率 %=（A0-A1）/A0×100%

1.2.5 菌株鉴定 对既具有抑菌活性又具有较强抗肿瘤、抗氧化活性的菌株进行鉴定。将菌株用CTAB法提取DNA，用ITS序列通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）；ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增［17］，PCR产物送上海生物工程有限公司进行双向ITS序列测定。测序结果在NCBI进行Blast比对后用MEGA7.0软件构建进化树，确定种属关系。

2 结果

2.1 龙脑樟树叶内菌的分离

采用不同培养基共从一年生龙脑樟树新鲜叶片中分离得到不同内生真菌39株，其中PDA培养基中分离出27株，察氏培养基中分离出12株。

2.2 抑菌活性测定

采用K-B纸片法对39株内生真菌的抑菌活性进行测定，以对4种病原菌抑菌圈直径均大于1 cm为筛选条件共筛选出7株具有广谱抑菌活性的内生菌，分别为ZS7、ZS13、ZS14、ZS17、ZS22、ZS23、ZS38。其中ZS7对大肠杆菌抑菌作用最强（抑菌圈直径1.60 cm）；ZS14对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强（抑菌圈直径为1.25 cm）；ZS22对铜绿假单胞菌抑菌作用最强（抑菌圈直径1.30 cm）；ZS13对枯草芽孢杆菌抑菌作用最强（抑菌圈直径为1.70 cm）（表 1）。

2.3 抗肿瘤活性测定

用7株筛选出的具有较强抑菌活性的菌株进行抗肿瘤活性的双重活性筛选结果（图1）显示，ZS13、ZS14、ZS38具有明显的抗肿瘤作用，MCF-7细胞经发酵液处理后形态发生明显变化，对照组细胞正常生长，实验组细胞有不同程度的裂解碎片聚集成团，形态变圆皱缩出现大量死亡，MTT结果显示ZS13、ZS14、ZS38对MCF-7细胞的抑制率分别为57.40%、73.00%、61.00%。

表1 内生真菌发酵产物的抑菌圈直径（cm）

2.4 抗氧化活性测定

用7株筛选出的具有较强抑菌活性的菌株进行抗氧化活性的双重筛选结果（图2-A）显示，不同菌株对DPPH自由基、OH自由基、H2O2均具有一定程度的清除能力。其中ZS14、ZS17对DPPH·清除作用较强（＞70%），ZS7、ZS13也显现出一定的清除作用（30%＜清除率＜70%）而ZS22、ZS23、ZS38清除能力则较弱（＜30%）。

图1 内生真菌发酵产物对MCF-7的抑制率

对OH·的清除结果（图2-B）显示，ZS14、ZS38对OH·具有较强的清除能力（＞70%），ZS7、ZS13、ZS17、ZS22、ZS23也显现出一定的清除作用（50%＜清除率＜70%）。

对H2O2清除作用结果（图2-C）显示，ZS7、ZS14、ZS17、ZS22、ZS38具有较强的清除能力（＞70%），ZS23也显现出一定的清除作用（40%＜清除率＜70%），ZS13清除能力则较弱（＜40%）。

综上所述，菌株ZS14既具有抑菌活性又具有较强抗氧化活性和抗肿瘤活性。

2.5 菌株鉴定

测序结果（图3）表明菌株ZS14的ITS序列长度为603 bp，BLAST比对与MF45131.1菌株的基因序列相似性达到100%。构建的系统发育树显示菌株ZS14与KT265344.1聚为同一支，均属于腐皮壳属，因此将ZS14命名为Diaporthalessp.ZS14。

3 讨论

植物内生真菌不仅种类繁多，其次生代谢产物的生理活性也是多种多样。在药用领域、农业领域、环境领域等都拥有不可或缺的作用［18］。目前研究人员已经从多种植物中分离出疱霉属、散囊菌属、刺盘孢属、拟茎点霉属等多种内生真菌［19］。

图2 内生真菌发酵产物抗氧化活性评价

龙脑樟树作为一种重要的药用植物，其提取物芳香油、樟脑及冰片［20］在农业、食品及医药等方面都具有广泛的应用［21］，但受到土地、气候及提取方式等条件的制约，价格一直居高不下。本研究对龙脑樟树叶片中的内生真菌进行了分离和研究，希望从中发现具有更强生物活性的菌株，从而通过微生物培育的方式寻找替代品。从龙脑樟树树叶中共分离出内生真菌39株，检测39株内生真菌的发酵液原液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制活性发现，其中的7株菌具有较强抑菌性且对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有活性。

对这7株菌株的生物活性进一步研究发现ZS14对MCF-7细胞具有最好的抑制作用，其抑制率达到了73%，在其发酵原液处理48 h后细胞出现明显变形和死亡。对ZS14的抗氧化研究发现其发酵原液对DPPH·的清除率达到70.92%；对OH·的清除率达到78.83%；对H2O2清除率达到81.36%，可见ZS14同时具有较强的抗氧化活性。最后ZS14被鉴定为Diaporthalessp.。

Diaporthesp.属于腐皮壳属，广泛存在于植物界中。王沫等［22］研究了广藿香内生真菌Diaporthesp. A616的细胞毒活性发现从从中分离出的（22E，24R）-ergosta-4，6，8，（14）-22-tetraen-3-one 和（22E，24R）-3β，5α-dihydroxy-6β-ergosta-7，22-diene 对 肿瘤细胞株SF-268，MCF-7，NCIH460和 HepG-2具有显著的抑制活性。Sousa等［23］对巴拿马的杂草中分离出的Diaporthesp. F2934次生代谢物研究发现其含有的肌肽A和C表现出抗各种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌活性。Ding等［24］对喜树的内生菌进行了分离，从中也发现了Diaporthesp.具有抑菌性。

以上研究表明腐皮壳属菌株具有强抑菌、抗肿瘤、抗氧化活性的潜力。而从龙脑樟树分离出来的内生菌具有与宿主植物相似代谢产物的特性，所以Diaporthalessp. ZS14其活性次级代谢产物的分离将作为下一步研究的重点，可以将其作为一个药物开发的潜在来源。

图3 基于菌株ZS14的rDNA-ITS基因序列同源性构建的系统发育树

4 结论

本实验通过对龙脑樟树叶中的内生真菌进行分离，并检测了菌株的抑菌、抗肿瘤、抗氧化活性。从中发现了内生真菌Diaporthalessp.ZS14，其具有最强的生物活性，具有较大的研究价值。