脆性组氨酸三联体和鼠双微体蛋白2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义

张春霆 林英立 徐旻 刘冉录 徐勇

膀胱尿路上皮癌与多种癌基因及抑癌基因异常表达有关，脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene，FHIT）在多种肿瘤组织中呈阴性表达[1-3]。鼠双微体2蛋白基因（murine doubleminute proteingene 2，MDM2）表达增高可抑制类胰岛素样生长因子2的mRNA结合蛋白质（p62蛋白），以促进细胞恶性转化和恶性肿瘤细胞的增殖[4-5]。笔者通过对FHIT和MDM2蛋白在Oncomine肿瘤数据库查询比对后，发现在膀胱尿路上皮癌中FHIT蛋白表达下降与MDM2蛋白表达增高密切相关，且FHIT蛋白表达下降及MDM2蛋白表达增高与膀胱肿瘤预后存在相关性。但FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的相关性尚未见报道，本研究对FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达情况进行研究，探讨两种蛋白之间及其与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 选取金华市人民医院（44例）、徐州市肿瘤医院（9例）、浙江大学金华医院（10例）和天津医科大学第二医院（9例）2009至2017年接受手术的膀胱尿路上皮癌患者的标本共72例，以及金华市人民医院（32例）、浙江大学金华医院（10例）正常膀胱尿路上皮组织共42例。术前均无放化疗及膀胱灌注史。72例患者中，男 42例，女 30 例，年龄 32～77（62.0±5.5)岁。纳入标准：再次经病理检查证实为膀胱尿路上皮癌,无其他部位肿瘤；分期临床资料完整，术前均未进行全身和膀胱灌注化疗、放疗和免疫治疗。分化程度为Ⅰ级47例，Ⅱ～Ⅲ级25例；分期（根据2002年国际抗癌联盟的TNM分期标准）为：Tis～T1期 38 例，T2～T4期 34 例；无淋巴结转移 54例，有淋巴结转移18例；有吸烟史38例，无吸烟史34例。

1.2 方法 鼠抗人FHIT蛋白（工作浓度1:100，规格：100μg，批号：BS6237）及鼠抗人 MDM2 蛋白（工作浓度1:150，规格：200μg，批号：abs130145）单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法试剂盒和二氨基联苯胺色试剂盒均购于福建迈新生物技术有限公司。组织常规石蜡包埋，以4μm厚度连续切片6张，分别作HE染色和免疫组化染色；免疫组化染色方法按说明书操作进行，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知FHIT、MDM2蛋白阳性切片作为阳性对照；由两位病理科医师读片以保证准确性。

1.3 结果判定 每张切片在高倍镜下选定5个视野，每个视野计数100个细胞，共计数500个细胞中肿瘤细胞的百分比，参照免疫组化半定量评分标准进行染色百分数评分：阳性细胞百分数＜50%时FHIT蛋白染色结果为（-），阳性细胞百分数≥50%时FHIT蛋白染色结果为（+）；MDM2蛋白染色结果判定同上。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件，计数资料组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman等级相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达 FHIT蛋白表达定位于胞质,呈棕黄色颗粒状；MDM2蛋白在正常组织中不表达，阳性表现为细胞核、胞质内出现棕黄色颗粒。两种蛋白在Ⅰ级和Ⅱ～Ⅲ级膀胱尿路上皮癌中的表达见图1a、b。

图1 两种蛋白在Ⅰ和Ⅱ～Ⅲ级膀胱尿路上皮癌中的表达（a：FHIT在Ⅲ级膀胱尿路上皮癌中表达；b：MDM2在Ⅰ级膀胱尿路上皮癌中表达；免疫组化染色，×200）

2.2 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及与临床病理特征的关系 FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中的阴性表达率为58.3%，在正常膀胱尿路上皮中为4.8%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。有吸烟史的FHIT蛋白阴性表达率为86.84%，无吸烟史的为29.41%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。FHIT蛋白阴性表达率与膀胱尿路上皮癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小、吸烟、年龄均有关（均P＜0.05），而与性别无关（P＞0.05）。MDM2蛋白在膀胱癌中阳性表达率为63.89%，在正常膀胱尿路上皮中为7.69%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。MDM2蛋白阳性表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小、吸烟均有关（均P＜0.05），与年龄、性别均无关（均P＞0.05），见表 1。

2.3 FHIT与MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中表达的相关性 FHIT与MDM2蛋白的表达呈负相关（r＝-0.816，P＜0.05），见表 2。

表1 FHIT和MDM2蛋白与膀胱尿路上皮癌临床病理特征之间的关系[例（%）]

3 讨论

研究发现膀胱尿路上皮癌的演化和进展是多步骤、多阶段、多基因参与的[6]，FHIT基因在膀胱尿路上皮癌中的阴性表达与膀胱尿路上皮癌预后相关[7-10]，MDM2有促进肿瘤细胞增殖、侵袭的生物学作用，使肿瘤细胞获得更强的转化和恶变能力，而FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌发生发展过程中是否有相关性，未见报道。

在膀胱尿路上皮癌早期，FHIT蛋白阴性表达率明显上升、甲基化可能是因素之一[11-12]。本研究中72例膀胱尿路上皮癌组织FHIT蛋白阴性表达率58.33%，42例癌旁正常膀胱尿路上皮组织FHIT蛋白阴性表达率为4.76%，两者比较差异有统计学意义，FHIT蛋白阴性表达与膀胱尿路上皮癌患者年龄、吸烟、TNM分期、淋巴结转移及分化程度均有关，与性别无关，这也证明了FHIT是容易受到外界干扰而突变的基因，年龄也可能影响FHIT基因突变；Stein等[13]实验表明，烟草致癌物增加了染色体脆性部位的表达导致FHIT基因阴性表达，这结果在本研究发现FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中表达下降得到了证实，在对吸烟和非吸烟患者FHIT蛋白表达情况研究发现，吸烟者FHIT蛋白阴性表达率（86.84%）明显高于非吸烟者（29.41%），推断烟草类等环境致癌物可能影响FHIT蛋白表达，烟草类物质导致FHIT异常可能是膀胱尿路上皮癌中的频发事件，其异常表达与膀胱尿路上皮癌发生发展有关。FHIT蛋白随分化程度的降低,阴性表达率有增高的趋势；FHIT蛋白阴性表达使肿瘤增殖能力及侵袭性逐渐增加[14]。伴随着FHIT蛋白表达的异常，MDM2蛋白也出现异常表达，研究表明激活p62基因能诱导MDM2基因的转录，转录后MDM2蛋白又使p62蛋白失活、降解，限制p62增高表达，从而保持细胞内MDM2/p62稳定[15]。MDM2阳性表达可以抑制p62，本研究中MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中阳性表达率为63.89%，正常膀胱尿路上皮为7.14%，两者比较差异有统计学意义，提示MDM2蛋白也是膀胱尿路上皮癌发生中的重要因素，MDM2蛋白阳性表达率与膀胱尿路上皮癌组织的TNM分期、淋巴结转移、分化程度、肿瘤大小、吸烟有关，与性别及年龄无关，MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中是否有相同的作用机制，有待进一步研究证实；本研究对FHIT和MDM2蛋白作单边相关性分析发现，FHIT蛋白阴性表达与MDM2蛋白阳性表达相关，两者呈负相关，提示在膀胱尿路上皮癌的发生、发展中两者可能起协同作用。

FHIT蛋白阴性表达有利于肿瘤的发生和进展，MDM2蛋白的阳性表达促进肿瘤侵袭和转移，联合检测上述两项指标，可为判断膀胱癌的恶性程度及转移潜能作重要参考。