Wnt信号通路对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的作用研究

吴国访，张淑沛

（河南省漯河市第六人民医院 神经内科，河南 漯河 462002）

近年来阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的发病率和发病人数急剧上升，目前普遍采用改善脑循环药物、能量代谢促进剂及乙酰胆碱酯酶抑制剂等治疗，但疗效有限[1]，而针对AD病因进行分子水平的治疗，可能成为改善AD症状、治愈AD的新方向。

神经细胞损伤及凋亡是AD的病理机制，而氧化应激损伤在神经退行性病变中具有重要的病因学意义[2]，目前，调控Wnt（wingless/integrated）信号通路对改变β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein,Aβ）诱导的PC12细胞氧化损伤的作用尚少见报道。本实验中选用PC12细胞株作为实验材料，研究Wnt3a对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的作用，阐明其对对抗氧化损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞（中国科学院细胞所）。

1.2 试剂

Bax（Sigma），Wnt3a（Sigma），细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC,PI双染）（凯基生物）。Bcl-2（Sigma），β-actin抗 体（Stanta Cruz），Amyloidβ（25-35）（human）（Sigma）。

1.3 方法

1.3.1 PC12细胞培养 PC12细胞接种于培养瓶，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）的饱和湿度培养箱中培养，培养基为含15%小牛血清DMEM。每3 d换液一次，3～4 d以1∶5进行传代。

1.3.2 AD模型制备 采用Aβ25-35诱导PC12细胞损伤制备AD模型：收集对数生长期的PC12细胞，重悬后以5×105/cm2的密度接种在6孔板表面生长。细胞长至80%融合时，换成新鲜培养基，其中含梯度浓度（10～50 µmol/L）Aβ25-35。加药24 h，收集细胞进行检测。

1.3.3 实验分组 根据损伤实验结果，确定实验Aβ25-3530 µmol/L培养基中加入经典Wnt通路的 激 活 50 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml Wnt3a，48 h以后收集细胞进行观察和检测。即实验设5组：①正常对照组；②Aβ25-35组；③Aβ25-35+50 ng/ml Wnt3a组；④Aβ25-35+100 ng/ ml Wnt3a组；⑤Aβ25-35+200 ng/ml Wnt3a。

1.3.4 WST-1法检测细胞的增殖活力 96孔培养版加入每组PC12细胞5 000个/孔。20 h后加入含WST-1溶液的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS），30℃孵育1 h后，震荡3 min，读取吸光度（optical density,OD）值，存活百分率=OD处理组/OD无处理组×100%。

1.3.5 流式细胞仪检测凋亡百分率 收集各组细胞，70%冰酒精固定30 min，加碘化丙啶（propidium iodide,PI）10 ng/ml及脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）抑制剂100 u/ ml室温孵育20 min。使用流式细胞仪测定各组的细胞周期，计算凋亡百分率。

1.3.6 Western Blot检测Tau蛋白磷酸化 各组中加细胞裂解液100 µl、PMSF2 µl，收集细胞，移至EP管后置于冰上10 min，4℃，1 000 r/min，离心10 min。取上清液后加入80 µl buffer重悬，水浴5 min。经电泳、转膜、加入抗体过夜反应后，暴光显影、定影后拍照。

1.4 统计学方法

用统计学软件SPSS l3.0对数据进行处理。实验数据为计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ25-35对PC12细胞的增殖活力影响

顺梯度浓度的Aβ25-35与PC12细胞孵育24 h，显示随着Aβ25-35浓度的递增细胞活力降低，结合细胞形态观察，本实验选取30 µmol/L作为Aβ25-35诱导AD细胞模型的适宜浓度，及进行后续研究。见图1。

2.2 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞增殖活力影响

细胞接种24 h后除对照组外其余均加入30 µmol/L Aβ25-35，后加入不同浓度（50、100、200 ng/ml）Wnt3a 48 h，如图2所示PC12细胞依赖Wnt3a浓度的增加而存活率升高，在浓度 100 ng/ml时达到最佳值50、100、200 ng/ml Wnt3a对应的细胞存活率与对照组相比，t值分别为2.621、9.877、16.326，P值分别为0.027、0.012、0.005。见图2。

2.3 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞形态和生长的影响

30 µmol/L作 为 Aβ25-35诱导AD细胞模型的适宜浓度，每个实验组分别加50 ng/ml、100 ng/ ml、200 ng/ml Wnt3a持续到48 h。观察细胞形态及生长情况，见图3。

2.4 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞凋亡的影响

流式细胞检测显示Wnt3a呈浓度依赖性的降低细胞凋亡率，但100与200 ng/ml Wnt3a对细胞凋亡率差异无统计学意义，见图4。

2.5 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞Bax、Bcl-2表达的影响

PC12细胞经30 µmol/L Aβ25-35处理后与正常对照组比较，胞质中Bax表达明显升高（t值2.284，P值0.004），而Bcl-2表达减少不明显（t值0.035，P值0.594），Bax/Bcl-2比值升高（t值6.894，P值0.015）；与Aβ25-35组相比显示，加50 ng/ml Wnt3a组Bax表达有降低，但差异无统计学意义（t值0.059，P值0.915），Bcl-2表达略有升高；加100 ng/ml组Bax表达明显下降（t值12.985，P值0.000），Bcl-2表达明显升高（t值15.982，P值0.001）。见图5。

图1 Aβ25-35对PC12细胞增殖活性的影响（n =6）

图2 wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞增殖活性的影响（n =6）

图3 细胞形态及生长情况

图4 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞凋亡的影响

图5 Wnt3a对Aβ25-35诱导后PC12细胞Bax、Bcl-2表达的影响

3 讨论

阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，临床表现包括进行性记忆减退、认知功能障碍等，病理显示大脑皮质和海马区神经细胞的丢失。机体的氧化损伤即机体内产生的氧自由基得不到及时清除，导致活性氧在体内堆积引起细胞毒性，是机体各组织老化的重要诱因，AD患者体内自由基生成增加，尤其是脑组织中神经细胞的氧化应激是导致其脑结构和功能改变的原因之一[3]。

Aβ是AD发病的始动因素[4]，一方面Aβ能够影响细胞骨架的完整性[5]，另一方面，Aβ还能干扰线粒体的功能障碍，导致培养基内的神经细胞受到氧化损伤[6]，因而Aβ成为AD治疗的重要靶标[7]。

Wnts调节细胞的生长过程，包括细胞的增殖、运动及凋亡，研究表明在Wnt信号途径转导中Wnt3a蛋白分子不仅保护细胞，还能增强细胞活力，其作用可能与Wnt3a抑制过氧化氢（H2O2）诱导细胞线粒体凋亡有关[8]。

本研究利用WST-1法检测细胞的增殖活力间接测线粒体酶的活力反映细胞活力，结果表明Aβ25-35与PC12细胞孵育能抑制WST-1代谢率，说明Aβ25-35对细胞线粒体功能造成障碍；Wnt3a能浓度依赖性改善WST-1代谢率，在Wnt3a100 ng/ml达到最佳值，表明Wnt3a对Aβ25-35释放毒性造成的线粒体损伤具有保护作用。形态学观察表明30 µmol/L Aβ25-35能使PC12细胞由菱形变成了扁形，表明细胞发生损伤；Wnt3a则能改善细胞的形态，表明Wnt3a能增加存活细胞数目。Annexin V/PI双染法显示Aβ25-35处理PC12细胞24 h后细胞损伤的主要形式是早期凋亡，Wnt3a100 ng/ml能减少早期凋亡细胞数目。

细胞凋亡与抗凋亡之间存在一种平衡，任何导致细胞凋亡启动分子均可促使细胞凋亡的发生自由基可通过线粒体依赖途径导致细胞凋亡[9]。Aβ25-35诱导PC12细胞Bcl-2表达下降，Bax表达上升，Bcl-2/Bax比值降低；Wnt3a 100 ng/ml与模型组比较Bcl-2表达上调，升高Bcl-2/Bax的比值升高，表明Wnt3a能抑制Aβ25-35引起的细胞凋 亡。

总之，Wnt3a可能通过Wnt信号通路抑制H2O2诱导线粒体凋亡通路，进而发挥保护由Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤。