不同浓度茶多酚服用对小鼠肠道菌群的影响研究*

于子婷

(北京实验动物研究中心，北京 100012)

肠道是人体消化吸收的重要场所，也是人体最大的免疫器官，在机体正常运作中发挥着极其重要的作用。据报道成年人的肠道中含有约 1000 多种不同类型的细菌，肠道菌群紊乱是2 型糖尿病、动脉硬化、肥胖症、骨质疏松、胃肠道疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、神经系统疾病的重要诱因[1-2]，因此保持肠道微生态的平衡对人体健康具有重要意义。

茶是世界第二大消费饮料，茶多酚是茶叶中多酚类物质及其衍生物的总称,主要由儿茶素、黄酮类、花青素、花白素和酚酸等物质组成[3]，茶多酚在原发高血压、高血脂的防治中作用显著。另外，茶多酚在消炎止泻上作用也比较明显。研究表明茶多酚可抑制很多真菌、细菌的活动。其杀菌及抑菌的种类有：口中的黏放菌、变链菌；消化器官中的金黄色链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、螺旋菌等多类细菌；皮肤上的白癣菌、新型隐形球酵母、发癣菌；为人体带来多种危害的棱菌属菌[4]。

随着肠道微生物的研究深入，研究发现茶叶中的不能被人体消化吸收的多酚和多糖对肠道微生物的调节可能是茶叶发挥其活性主要作用的靶点之一[5]，本研究主要研究茶叶中的茶多酚在影响宿主的肠道微生物多样性及结构中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 实验动物与分组

将 24 只 C57BL/6 J 小鼠在恒温、恒湿的 SPF 级动物房中适应性饲喂1周，严格控制 12 h 光照/黑暗，环境温度设定为 23℃，期间小鼠自由进食和进水。该动物实验中所用的方法都经过北京实验动物研究中心动物伦理协会批准。1周适应期结束后，24只8周龄SPF级C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组6只：对照组(CK，不添加茶多酚)、低剂量茶多酚组(LTP，饮水中添加0.4 g/L GTP)、中剂量茶多酚组(MTP，饮水中添加0.8 g/L GTP)、高剂量茶多酚组(TP，饮水中添加1.6 g/L GTP)。4组均给予常规饲料，茶多酚饮水每天更换一次，连续14 d。

1.3 样品采集及处理

处理14 d后，收集小鼠直肠中的新鲜粪便，约150 mg，放入无菌的 EP 管中，密封，1 h内置于-80℃冰箱进行保存，所有的操作需在 1 h 内完成。

1.4 DNA 提取

DNA提取方法参照DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross,GA,U.S.)试剂盒说明书。提取得到的DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度法(A260 nm/A280 nm光密度比)进行质量检测。检测后，将样品于20 ℃保存以备后续实验使用。

1.5 MiSeq 测序

微生物多样性检测选取细菌16SrDNA V3-V4区，样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用 Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。细 菌 16S rDNA V3-V4 扩 增 引 物 为 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’)。PCR反应体系：12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix, 3 μL BSA(2ng/μL), 2 μL Primer(5 μmol/L), 2 μL 模板 DNA, 和5.5 μL ddH2O。反应参数：95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 生物信息学分析

通过Illumina MiSeq 平台进行Paired-end 测序，下机数据经过QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除打分低于20、 碱基模糊、引物错配或测序长度小于150 bp的序列。 根据barcodes归类各处理组序列信息聚类为用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，OTU 相似性设置为97%。对比silva数据库，得到每个OTU 对应的物种分类信息。 再利用Mothur 软件(version 1.31.2)进行Shannon指数分析。基于Weighted Unifrace 距离，使用R(v3.1.1)软件包的heatmap 进行聚类分析。

基于每个样本的OTU信息，使用R语言vegan与ggplot2等软件包进行数据计算NMDS分析和作图。基于每个样本的OTU信息，使用R语言进行PCA统计分析和作图。

1.7 统计方法

不同组之间的显著性差异通过进行 One way ANOVA 进行判断(t检验)，利用 SPSS 19.0 软件进行以上统计学分析，P<0.05则认为差异显著。

2 结果

通过对24个小鼠粪便样本的16 s rRNA基因V3-V4区进行测序，结果总共获得1 253 144条tags序列，平均每个样本(52 114±41 441)条tags序列，经过聚类分析共产生 391个聚类分析单元(OTU，operational taxonomic unit)，全部样本的Good’s coverage值均大于99%，反映本次测序结果代表了样本中微生物的真实情况。实验结果表明：24个样本中总共发现9个门，15个纲，19个目，32个科，67个属。

物种组成分析结果表明在科水平上HTP组，MTP，LTP和CK中Bradyrhizobiaceae(P=0.02)，Methylobacteriaceae(P=0.02)，Rhizobiaceae(P=0.016)，Staphylococcaceae(P=0.007)，Carnobacteriaceae(P=0.003)和Rhodobacteraceae(P=0.000473)存在明显差异(见表1)。在科水平的热图中也显示各组之间存在明显差异(见图1)

表1 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组在科水平上的差异比较Table 1 Comparison of Family Level between Normal Group, Low DoseGroup, Medium Dose Group and High Dose Group

图1 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组的热图分析Fig.1 Thermographic analysis of normal group, low dose group,medium dose group and high dose group

Anosim相似性分析结果显示HTP组与CK、LTP和MTP具有显著差异(R值0.7111，P值0.003；R值0.7093，P值0.004；R值0.6167，P值0.008)(见表2)。shannon值分析结果表明HTP组群落多样性较高(见图2)。

表2 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组Anosim相似性分析Table 2 Anosim similarity analysis betweennormal group,low dose group, mediumdose group and high dose group

NMDS数据分析表明HTP组与CK、LTP和MTP明显分离(见图3)，说明HTP组与CK、LTP和MTP组相比差异明显。PCA数据分析也表明HTP组与CK、LTP和MTP明显分离(见图4)。

图2 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组shannon值分析Fig.2 Analysis of Shannon values in normal group, lowdose group, medium dose group and high dose group

图3 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组NMDS数据分析Fig.3 Analysis of NMDS data in normal group, low dosegroup, medium dose group and high dose group

图4 正常组、低剂量组、中剂量组与高剂量组PCA数据分析Fig.4 Analysis of PCA data in normal group, low dosegroup, medium dose group and high dose group

3 讨论

近年来，植物多酚相关的产品保健食品、疾病预防及辅助治疗领域已经受到广泛关注[6]。很多植物多酚进入人体消化系统后是通过与肠道微生物相互作用而被利用的，一方面微生物可以转化多酚类物质使多酚发生开环、脱甲基、脱羟基、水解、解聚还原等生化反应从而生成新的代谢产物，另一方面多酚也有类似低聚糖的益生效果，可以影响肠道微生物的结构、组成和功能[7-8]。

本实验我们通过对24只饮用不同浓度的茶多酚的C57BL/6 J小鼠进行肠道微生物的检测，从而来研究茶多酚对肠道微生物的影响及作用。实验中shannon值分析结果表明高浓度茶多酚摄入可增加肠道菌群的多样性，Anosim相似性分析结果也显示了类似的结果。本结果与Liu 等人利用高脂诱导的肥胖小鼠模型较绿茶、乌龙茶和红茶对高脂诱导紊乱小鼠肠道菌群影响结果一致[9]，可能由于茶多酚具有类似低聚糖的益生效果，影响了肠道微生物的多样性、结构和组成[7]。值得注意的是茶多酚需要达到一定浓度才可以有效改变肠道微生物。

另外，本研究结果表明在中剂量组和高剂量组中乳酸杆菌的含量明显高于低剂量和对照组(P=0.038)，结果与曾婷玉等利用不同剂量的茯砖茶水提物(15.75、31.5、63 mg/day/mouse)对小鼠肠道中乳杆菌的影响结果相一致，并且本研究也显示茶多酚对乳杆菌的增殖效果最为明显并且呈剂量依赖性[10]。此外，实验结果显示在HTP组中Bradyrhizobiaceae， Methylobacteriaceae， Rhizobiaceae， Staphylococcaceae， Carnobacteriaceae和Rhodobacteraceae含量明显升高。因而可以推测，茶多酚具有可以增加肠道微生物的多样性，增加益生菌的比例及改变菌群组成的功能。