海兰褐鸡肠道菌群多样性分析

王海花 ， 张晓峰 ， 祁画丽 ， 包文奇

(河南牧业经济学院动物医学院 郑州市兽医生物技术重点实验室 , 河南 郑州 450046)

肠道菌群被誉为机体自身的“黑匣子”,是肠道重要的的组成部分,与宿主自身营养物质的消化、代谢以及免疫功能等方面密切相连[1-2]。肠道菌群与宿主之间的这种动态平衡，对动物机体生命活动的正常运转具有十分重要的意义。一旦这种平衡被打破(如疾病等)，条件性的肠道致病菌便会趁虚而入，动物就有可能产生一系列胃肠道疾病。研究表明，不只是胃肠道疾病，许多疾病都与肠道微生态失调有关系[3-4]。随着养禽行业迅速发展，肠道菌群失调导致家禽疾病越来越严重，因此，关注家禽肠道健康，研究其肠道菌群结构及变化规律有助于调节肠道菌群平衡[5]。本试验采用不同培养基对海兰褐鸡肠道菌群进行分离培养和16S rDNA测序，并进行分类学和系统发育研究，将为开发更有针对性的微生态制剂产品提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料 10周龄海兰褐鸡来源于河南牧业经济学院动物医院。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的采集及处理 选取10周龄海兰褐鸡，分为健康鸡、非健康和服用过微生态制剂(主要益生菌为枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，屎肠球菌)3组，每组选20只，选取的肠段为十二指肠，空肠、盲肠，各肠断取约10 cm长度，称其重量，剪碎，分别放入盛有100 mL无菌生理盐水的三角瓶中，用恒温培养摇床摇20 min(120 r/min)[6-7]。

1.2.2 细菌基因组DNA提取 挑取单菌落到5 mL盛有LB和MRS液体培养基的PA瓶中，30 ℃活化3-4 h，培养液稍浑浊，取1 mL加入1.5 mL灭菌离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清液，再加1 mL STE悬浮菌体，12 000 r/min离心1 min，弃上清。向收集的菌体中加入100 μL TE，沸水煮10 min，立即冰浴10 min，离心5 min取上清液即为DNA模板，将基因组DNA放于-20 ℃，保存备用。

1.2.3 目的基因的扩增与测序 细菌16S rDNA 基因序列的扩增采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增。PCR扩增体系(40 μL)：以提取的细菌基因组DNA为模板2 μL，上游引物(27 F)1 μL，下游引物(1 541 R)1 μL，Taq酶20 μL，ddH2O 16 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃复性1 min，28个循环，72 ℃延伸10 min,扩增产物4 ℃保存，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。观察1 500 bp目的片段的条带是否扩增出来。凡是扩增成功的PCR产物都送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 16S rDNA 序列测定及系统发育分析 将测序成功的菌株序列，选取10～1 500 bp序列，输入到韩国的EzTaxon-e数据库(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)中的Identify程序，然后对所得的16S rDNA 基因序列进行菌株相似性信息比对，挑选出与其同源性最高的标准菌株序列。然后用Clustal X 软件将菌株测序出来的基因序列和标准菌株序列进行比对，利用MEGA6软件，采用邻接法构建菌株间的系统发育树，了解菌株的遗传进化信息。

2 结果与讨论

2.1 健康海蓝褐鸡肠道细菌多样性及系统进化分析 本试验从健康海兰褐鸡的不同肠道中共分离到30株细菌，经16S rDNA 基因序列比对后获得16种不同的细菌，结果如表1。

表1 健康海兰褐鸡肠道细菌16S rDNA序列鉴定结果

由表1可知，从健康鸡的肠道中共分离到16种不同细菌，分属8个不同属，其中属于乳酸杆菌属的有4个，分别为乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌，占25%；属于芽孢杆菌属的有3个，分别为特基拉芽孢杆菌、Bacillussiamensis、枯草芽孢杆菌，占19%；属于肠球菌属的有3个，分别为耐久肠球菌、乳酸肠球菌、粪肠球菌，占19%；属于大肠埃希菌属的有2个，分别为阿尔伯蒂埃希杆菌、大肠埃希菌，占13%；属于不动杆菌属的有1个，为谷氨酸不动杆菌；属于葡萄球菌属的有1个，为葡萄球菌；属于巨球菌属的有1个，为Macrococcuscaseolyticus；属于志贺菌属的有1个，为Shigellaflexneri，各占6%，由此可见，在健康鸡的肠道中乳酸杆菌属、芽孢杆菌属和肠球菌属为优势微生物，其中绝大多数为国家农业部公布的益生菌名录中的益生菌。

采用Clustal X 软件将分离出来的16株菌株的16S rDNA 基因序列和标准菌株序列进行比对，利用MEGA6软件，采用邻接法构建菌株间的系统发育树，了解菌株的遗传进化信息，健康海兰褐鸡肠道微生物系统进化结果如图1。

由图1可以看出从健康鸡的肠道中共分离到16种不同的细菌被聚类成三大分枝，其中肠球菌属和乳酸杆菌属聚类为第一分枝，绝大多数芽孢杆菌聚类为第二分枝，而其余的细菌聚类为第三分枝，因此，从细菌种类结构来说，健康海兰褐鸡肠道微生物主要为乳酸杆菌属、芽孢杆菌属和肠球菌属，它们为健康海兰褐鸡肠道中为优势菌。

2.2 非健康海兰褐鸡肠道微生物多样性及系统进化分析 从非健康海兰褐鸡不同肠道中共分离到15株细菌，经16S rDNA 基因序列比对后获得10种不同的细菌，结果如表2。

图1 健康海兰褐鸡肠道微生物系统发育进化树

表2 得病海兰褐鸡肠道细菌16S rDNA序列鉴定结果

由表2可知，非健康海兰褐鸡的肠道中共分离到10种不同细菌，从种属结构来看，10种不同细菌分为8个不同属，其中属于志贺菌属的有2个，为鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌，占20%；属于克雷伯菌的有2个，分别为肺炎克雷伯菌、Klebsiellaquasipneumoniae，占20%；属于肠球菌属的有1个，为粪肠球菌，占10%；属于肠杆菌属的有1个，为路德维希肠杆菌，占10%；属于气单胞菌属的有1个，为Aeromonasbestiarum，占10%；属于埃希菌属的有1个，为弗氏埃希菌，占10%；属于乳酸杆菌属的有1个，为罗伊氏乳酸杆菌，占10%；属于巨型杆菌属的有1个，为巨型球菌，占10%；由此可见，在非健康鸡肠道中志贺菌属和克雷菌属为优势细菌。

采用Clustal X 软件将分离出来的10株菌株的16S rDNA 基因序列和标准菌株序列进行比对，利用MEGA6软件，采用邻接法构建菌株间的系统发育树，非健康海兰褐鸡肠道细菌系统进化结果如图2。

图2 非健康海兰褐鸡肠道细菌系统发育进化树

由图2可以看出，从得病海兰褐鸡的肠道中共分离到10种不同的细菌被聚类成2大分枝，其中第1分枝7株细菌属于变形杆菌门，占70%，第2分枝3株细菌属于厚壁菌门，占30%，因此，从细菌种类结构来说，非健康海兰褐鸡肠道细菌主要为变形杆菌门的细菌。

2.3 饲喂微生态制剂的海兰褐鸡肠道细菌多样性及系统进化分析 从饲喂过混合微生态制剂2周的健康海兰褐鸡的肠道中共分离到19株细菌，经16S rDNA 基因序列比对后获得14种不同的细菌，结果如表3。

表3 服用过微生态制剂的海兰褐鸡肠道细菌16S rDNA序列鉴定结果

由表3可知，从饲喂过微生态制剂的海兰褐鸡肠道中共分离到14株不同的细菌，从种属层面来看，14株不同的细菌分属12个不同的属，其中属于肠球菌属的有3个，分别为粪肠球菌、海氏肠球菌、屎肠球菌，占21%；属于芽孢杆菌属的有2个，Bacillussiamensis和赖氨酸芽孢杆菌，占14%；属于柠檬酸杆菌属的有1个，为柠檬酸杆菌；属于气单胞菌属的有1个，为气单胞菌；属于不动杆菌属的有1个，为谷氨酸不动杆菌；属于金黄杆菌属的有1个，为Chryseobacteriumginsengisoli；属于葡萄球菌属的有1个，为葡萄球菌；属于寡养单胞菌属的有1个，为Stenotrophomonaspavanii；属于乳酸杆菌属的有1个，为唾液乳杆菌；属于志贺菌属的有1个，为弗氏志贺菌；属于克雷伯菌属的有1个，为肺炎克雷伯菌，各占7%，由此可见，在饲喂微生态制剂的鸡的肠道中肠球菌属和芽孢杆菌为优势细菌，其中粪肠球菌、屎肠球菌、唾液乳杆菌及芽孢杆菌为益生菌。饲喂过微生态制剂的海兰褐鸡肠道细菌系统发育进化树如图3所示。

图3 饲喂微生态制剂海蓝褐鸡肠道细菌系统发育进化树

由图3可以看出，从饲喂微生态制剂海兰褐鸡的肠道中共分离到14种不同的细菌被聚类成3大分枝，其中第1分枝7株细菌为变形杆菌门，第2分枝5株细菌为厚壁菌门，第3分枝1株细菌为拟杆菌门(Bacteroidetes)，从细菌种群结构来说，饲喂微生态制剂海兰褐鸡肠道细菌种类更多。

3 结论

3.1 从微生物种群结构来看，健康海蓝褐鸡肠道中共分离到16种不同微生物，分属厚壁菌门(Firmicutes)和变形杆菌门(Proteobacteria)，其中厚壁菌门占75%，变形杆菌门占25%，厚壁菌门占优势；从种属层面来看，优势微生物为乳酸杆菌属、芽孢杆菌属和肠球菌属的微生物，分别占25%、19%、19%。非健康海兰褐鸡的肠道中共分离到10种不同微生物，分属变形杆菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，其中变形杆菌门占70%，厚壁菌门(Firmicutes)占30%，变形菌门占优势；从种属层面来看，优势微生物为志贺菌属和克雷菌属，分别占20%、20%。饲喂过微生态制剂的海兰褐鸡肠道中共分离到14株不同的微生物，主要分布在变形杆菌门(Proteobacteria)占57%，厚壁菌门(Firmicutes)占36%，拟杆菌门(Bacteroidetes)占7%，从种属层面看，优势微生物为肠球菌属和芽孢杆菌，分别占21%和14%。

3.2 粪肠球菌、乳酸杆菌、志贺菌在不同健康状态的海兰褐鸡肠道中都存在，肠球菌为兼性厌氧菌，屎肠球菌和粪肠球菌都广泛分布在各个肠段。乳酸杆菌属于有益菌，是动物健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物消化。而志贺菌是细菌性痢疾最为常见的病原菌，能够引起拉稀、腹泻等症状。其中健康状态和饲喂微生态制剂的海兰褐鸡肠道微生物以肠球菌属和乳酸杆菌属为主，而患病的海兰褐鸡的肠道微生物以志贺菌为主，也说明饲喂微生态制剂对调节动物肠道微生态，增强肠道有益微生物数量,提高动物肠道健康有重要意义。