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犬利什曼原虫病例报告

2019-05-16刘宏锋张伟伟

中国兽医杂志 2019年11期
关键词:原虫测序婴儿

单 敏 , 安 娜 , 刘宏锋 , 张伟伟 , 刘 欣

(1.联宠国际检测中心 , 北京 海淀 100089 ; 2.美联众合动物医院转诊中心 , 北京 朝阳 100012)

利什曼原虫(Leishmaniaspp.)属于锥体虫科利什曼虫属的原虫,该原虫会引起人及多种动物利什曼病,是一种重要的人兽共患病。利什曼原虫主要感染对象包括蹄兔目、啮齿目、犬科和人类。该病发展缓慢,具有一定的潜伏期,临床表现为不规则发热,肝脾肿大,渐进性贫血和血浆球蛋白升高等。利什曼原虫的生活史包括前鞭毛体和无鞭毛体2个时期。前者寄生于节肢动物(白蛉或罗蛉)的消化道内,后者寄生于哺乳动物的巨噬细胞内,通过白蛉叮咬传播。目前全世界有88个国家报告过利什曼原虫症的病例,威胁健康人数达3.5亿[1]。我国关于利什曼原虫感染的病例报道较少,本文就2例犬利什曼原虫感染病例介绍如下。

1 病例情况

1.1 病例1 雄性泰迪犬,2岁。注射狂犬疫苗后,出现脱毛,厌食,身体消瘦,发热等临床症状。右侧肩胛部大片脱毛,被覆大量白色结痂,四肢及眼周存在少量结痂,皮肤与黏膜结合处轻微破溃结痂。

1.2 病例2 雌性杂种犬,1岁。最初表现为打喷嚏,2周后出现鼻出血,发热症状,后又出现便血症状。体格检查发现下颌淋巴结及腘淋巴结肿大。

2 实验室检验

2.1 血常规及血液生化检测 病例1及病例2均显示动物存在贫血(见表1),血液生化结果显示,两例患犬球蛋白水平显著升高(见表2)。

2.3 显微镜观察 对病例1体表结节及病例2淋巴结进行细胞学检查,均可见巨噬细胞内存在大量的利什曼原虫无鞭毛体结构(见中插彩版图1及图2)。

图1 病例1体表结节细胞学检查(Diff-Quik染色,1 000×)

图2 病例2淋巴结细胞学检查(Diff-Quik染色,1 000×)

表1 血常规检测结果

表2 生化检测结果

2.4 PCR检测和分型

2.4.1 目的基因PCR扩增 将病例1的皮肤刮取物、淋巴组织和病例2的血液样本送至联宠国际检测中心进行PCR鉴定。联宠国际检测中心对临床收集的病例1和病例2样本分别提取基因组DNA,随后用利什曼原虫的18S rDNA特异性引物进行PCR扩增,将样品PCR产物进行凝胶电泳,电泳条带大小为602 bp(见图3和图4),与预期扩增片段大小相符,证实为利什曼原虫。

图3 病例1 18S rDNA基因PCR鉴定
M: DNA分子量标准 ; 1: 病例1 ; N: 阴性对照

2.4.2 序列测定和分型 为进一步对利什曼原虫分型,将用18S rDNA引物扩增的目的产物进行测序,测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将测序结果进行Blast序列比对,比对结果与杜氏、婴儿和恰氏利什曼原虫的同源性为100%,再次表明该病例为利什曼原虫病。为进一步确诊利什曼原虫的分型,用LGITSF2/LGITSR2引物进行PCR扩增[2],PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,结果显示,获得约400 bp的特异性片段(见图5和图6),与预期扩增的片段大小(372~450 bp)相符。之后将获得的PCR扩增产物测序,将测序结果进行比对,用于区分杜氏和婴儿/恰氏利什曼原虫两种亚型(见图7)。经比对表明病例1和病例2均为婴儿/恰氏利什曼原虫感染。

图4 病例2 18S rDNA基因PCR鉴定
M:DNA分子量标准 ; 2:病例2 ; N:阴性对照

图5 病例1 LGITS基因PCR扩增产物的鉴定
M: DNA分子量标准 ; 1: 病例1 ; N: 阴性对照

图6 病例2 LGITS基因PCR扩增产物的鉴定
M:DNA分子量标准 ; 2:病例2 ; N:阴性对照

图7 基因片段序列1801269064-A:病例1LGITS基因片段序列 ;1803089981-B:病例2LGITS基因片段序列

3 治疗

根据临床症状和实验室检测确,诊该两犬患有利什曼原虫病后,采用别嘌呤醇(10~20 mg/kg·bw,每天2次,口服,连用6-18个月)和米替福新(2 mg/kg·bw,每天1次,与食物同时口服,连用4周)进行治疗。

4 治疗结果

经过治疗后,病例1和病例2临床症状均有缓解,血常规检测各项结果均在正常参考范围内,血液生化检测结果显示,球蛋白水平高于正常水平(表3)。

表3 生化检测结果

5 讨论

在我国人群中主要流行杜氏利什曼原虫,杜氏利什曼原虫是黑热病的病原。犬源型的病原为婴儿利什曼原虫,且犬的感染率高,人的感染大都来自病犬,散在发生[3]。1990年WHO利什曼病专家委员会将杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和恰氏利什曼原虫三者视为杜氏利什曼原虫复合体[4]。现许多学者将婴儿利什曼原虫和恰氏利什曼原虫视为同一型[3]。

利什曼原虫的感染机制复杂,所致临床症状存在较大差异[5]。犬感染利什曼原虫潜伏期可长达6周-7年,早期逐渐发病,症状不典型,主要以发热、脾脏、淋巴结病变为主[6]。虫体侵入机体后主要引起多脏器感染,并引起消瘦、食欲不振、沉郁、咳嗽等临床症状,皮肤病变特征为过度角质化、增厚、皮屑以及皮肤、黏膜的溃疡。

经检测病例1和病例2出现血细胞减少和血浆球蛋白升高等症状,初步符合利什曼原虫病临床症状。针对利什曼原虫的检测最早主要是基于细胞学检查,观察到原虫就即可确诊[3]。经显微镜观察,在病例1和病例2的巨噬细胞内均存在大量的利什曼原虫无鞭毛体。但当宿主体内虫体量较低时细胞学检查可能出现假阴性结果。

在利什曼原虫检测方法中,PCR技术具有较高的灵敏性和特异性[7]。已有研究表明,PCR法可对血液中的利什曼原虫特异DNA片段进行高效扩增检测,具有病原学诊断的意义,且能通过片段序列比对分析致病虫种[8]。本病例中,用LGITSF2/LGITSR2引物进行PCR扩增并测序,2只患犬的测序结果与婴儿利什曼原虫病的同源性为100%。

犬利什曼原虫病的主要感染源来自于病犬,无论是感染利什曼原虫的犬还是人类,较长的潜伏期及不明显的临床症状,都使临床上出现较多的误诊的情况。PCR法检测方法具有较高的敏感性和特异性,能高效地发现无症状犬或感染犬,有助于较好的指导犬利什曼原虫病的预防控制工作。

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