SIAH1核异位表达抑制乳腺癌细胞凋亡的作用机制

蔡存伟，温媛媛，李晓燕，张丽娜

（1. 中国医科大学肿瘤医院，辽宁省肿瘤医院病理科，沈阳 110042； 2. 浙江省舟山医院病理诊断中心，浙江 舟山 316021）

目前，乳腺癌发病率已跃居我国女性恶性肿瘤首位［1］。乳腺癌发病受多种因素 （遗传和环境因素等） 影响。乳腺癌细胞具有异常增殖、分化程度低、侵袭能力强、转移发生早和细胞凋亡减少等特征，其中凋亡机制异常认为与乳腺癌的发生密切相关［2］。SIAH1 （seven in absentia homologue-1） 含有环指结构，具有E3泛素连接酶活性，参与泛素化和蛋白酶体介导的特定蛋白质降解。传统观点认为SIAH1可介导包括自身在内的多种目标蛋白的泛素-蛋白酶体降解过程［3］。近年来研究［4-10］发现SIAH1亦与肿瘤细胞凋亡密切相关，但具体作用及机制尚不清楚。

S-亚硝基谷胱甘肽 （S-nitrosoglutathione，GSNO）是机体内源性一氧化氮供体，高浓度GSNO会对机体产生毒性。GSNO使带有游离巯基的蛋白发生S-亚硝基化修饰。研究［11］发现GSNO可以使细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 发生S-亚硝基化，S-亚硝基化的GAPDH可以和SIAH1结合，使SIAH1入核选择性地降解目标蛋白。

前期研究［12］发现单纯性增生乳腺组织发展为浸润性癌的过程中，SIAH1蛋白在细胞质中表达逐渐降低，而在细胞核中表达逐渐升高，出现明显的核内蓄积趋势。同时前期研究［13］表明细胞质内SIAH1可通过激活MAPK/JNK/c-jun通路促进Bim mRNA和蛋白表达，进而诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究探讨乳腺癌中SIAH1蛋白细胞核-细胞质穿梭现象的原因，进一步观察SIAH1核异位后对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

收集浙江省舟山医院病理科2014年至2015年40例原发性乳腺浸润性导管癌手术切除石蜡标本，患者年龄为33～76岁 （中位年龄49岁），所有患者术前均未接受放化疗，所有病理资料均由2名高级职称病理医师联合诊断。本研究及所有标本使用经舟山医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

主要试剂包括S-P免疫组织化学检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒 （DAB-0031） （中国福州迈新生物技术公司）；鼠抗人SIAH1抗体 （美国Santa Cruz公司），兔抗人Bim抗体 （美国Santa Cruz公司），β-actin抗体 （北京中杉金桥生物技术有限公司）；SIAH1 siRNA （美国Santa Cruz公司）；DMEM培养液、胎牛血清 （美国GIBCO公司）； Lipofectamine 2000、核蛋白提取试剂盒 （美国Invitrogen公司） 。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色及结果判定：标本经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μ m切片，按照S-P免疫组织化学检测试剂盒说明书步骤进行SIAH1 （1∶200） 免疫组织化学染色。SIAH1核异位表达判定标准：以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色。

1.2.2 细胞培养及SIAH1核异位表达乳腺癌细胞模型的构建：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2环境下培养乳腺癌细胞系MCF-7。随后在MCF-7细胞中加入100 mmol/L GSNO培养24 h后收集细胞。

1.2.3 RNA干扰：干扰片段为 SIAH1 siRNA、control siRNA和 E2F1 siRNA，按照脂质体Lipofectamine 2000试剂说明书进行操作、转染，培养48 h后收集细胞。

1.2.4 Western blotting检测：按照相应蛋白提取试剂盒说明书分别提取核蛋白及总蛋白，测定蛋白浓度，样品和上样缓冲液以4∶1混合，SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗山羊抗人SIAH1 （1∶400），兔抗人Bim （1∶400），抗β-actin（1∶200） 和兔抗人LaminB1 （1∶400），4 ℃ 孵育过夜；Ⅱ抗 （酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，上海基因科技股份有限公司） 孵育2 h，TBST洗脱3次，发光显影；应用Image J软件进行蛋白条带灰度分析。实验至少重复3次，计算平均值。

1.2.5 免疫荧光及共聚焦实验：乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入100 mmol/L GSNO培养24 h后，将细胞接种到预先放置处理过盖玻片的培养皿中，细胞长成单层后取出盖玻片，PBS洗2次；甲醇固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；1%Triton 通透30 min，PBS洗3次，每次5 min；封闭30 min；一抗室温孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；50 μ g/mL FITC室温避光孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；蒸馏水漂洗1次，DAPI（1∶200） 染色细胞核；滴加封片剂封片，在共聚焦荧光显微镜下观察。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：收集细胞，加入300 μ L 1×binding buffer 悬浮细胞，加入Annexin V-FITC （5 μ L） 混匀后进行Annexin V-FITC标记，加入PI （5 μ L） 染色，最后进行流式细胞仪分析。

1.2.7 GSNO合成：取4 mL GSH，加 2 mL HCl酸化，加入4 mL NaNO2，混合冰浴反应20 min，加入40%NaOH调整pH至7.0左右，避光保存。产物稀释200倍，PBS为阴性对照，酶标仪测定334 nm处吸光度。计算GSNO浓度，利用PBS调整终浓度为100 mmol/L。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，并计算Spearman等级相关系数，计量资料比较采用t检验或方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中存在SIAH1核异位表达蓄积现象

前期研究［12］发现，SIAH1在正常乳腺组织中细胞质高表达，而细胞核阴性表达。在乳腺癌癌变过程中细胞质内SIAH1蛋白表达逐渐下调，且与乳腺临床病理因素 （临床分期、分化） 显著相关。本研究结果显示，部分患者乳腺癌组织中 （12/40） 乳腺癌细胞核内检测出SIAH1阳性信号，SIAH1核表达在乳腺癌组织中高于对应的癌旁正常组织 （图1） 。

2.2 GSNO诱导SIAH1核异位表达的乳腺癌细胞系构建

图1 SIAH1在正常乳腺组织及乳腺癌组织中的表达 ×200Fig.1 Expression of SIAH1 in normal breast tissue and breast cancer tissue ×200

为进一步研究SIAH1核异位表达对细胞功能的影响，本研究构建了GSNO诱导的SIAH1核异位表达的乳腺癌细胞系模型。激光共聚焦方法检测结果显示，乳腺癌MCF-7细胞中SIAH1主要在细胞质内低表达；给予100 mmol/L GSNO刺激后SIAH1在细胞核内表达增加 （图2） 。Western blotting检测结果表明，与对照组 （0.31±0.01） 比较，加入50 mmol/L和100 mmol/L GSNO刺激后，SIAH1核蛋白表达 （分别为1.21±0.20，1.85±0.35） 明显增加 （均P < 0.05） 。

2.3 SIAH1核异位表达抑制细胞凋亡

图2 MCF-7乳腺癌细胞系SIAH1的表达及定位 ×200Fig.2 Expression and localization of SIAH1 in MCF-7 the breast cancer cell line ×200

流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡结果显示，与对照组 （11.02%±1.310%） 比较，加入100 mmol/L GSNO的实验组可明显抑制乳腺癌细胞凋亡 （24 h：2.02%±0.310%；48 h：1.06%±0.091%），差异均有统计学意义 （F分别为110.317、130.113，P分别为0.038、0.041），见图3。

在乳腺癌MCF-7细胞系中应用siRNA片段干扰SIAH1的表达，与对照组比较，SIAH1siRNA组SIAH1的核蛋白表达缺失，见图4 。在MCF-7-SIAH1SiRNA细胞中应用100 mmol/L GSNO处理24 h及48 h，流式细胞仪检测凋亡率结果显示，GSNO处理组在24 h及48 h后细胞凋亡率分别为0.83%±0.338%、0.72%±0.653%，与对照组 （1.05%±0.910%） 比较无统计学差异 （均P > 0.05），见图5。

2.4 GSNO诱导SIAH1核转位后E2F1/Bim的表达下降

图3 流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡情况Fig.3 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

图4 SIAH1核蛋白表达Fig.4 SIAH1 nuclear protein expression

Western blotting检测结果表明，在MCF-7细胞中应用100 mmol/L GSNO刺激后，与对照组比较，SIAH1核蛋白表达增加，而E2F1和Bim蛋白表达均降低。在MCF-7细胞GSNO刺激的同时siRNA干扰E2F1结果发现，与对照组比较E2F1和Bim蛋白表达均下降 （图6） 。

图5 流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡情况Fig.5 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

图6 SIAH1核蛋白表达Fig.6 SIAH1 nuclear protein expression

凋亡结果显示，与未处理组比较 （10.32%±1.110%），MCF-7细胞GSNO刺激同时siRNA干扰E2F1组细胞凋亡率 （0.82%±0.021%） 明显下降，差异有统计学意义 （F = 131.063，P < 0.05），见图7。

3 讨论

YOSHIBAYAS等［14］研究发现，SIAH1可通过依赖β-catenin降解和不依赖β-catenin降解2条途径共同促进肝癌细胞凋亡。HE等［15］研究表明SIAH1可通过增强放射线敏感度促进乳腺癌细胞凋亡。而KUROKAWA等［16］发现SIAH1可以降低促凋亡蛋白HIPK2稳定性，提示其可能发挥抑制细胞凋亡作用。前期研究［12］提示SIAH1作为肿瘤抑制因子在乳腺癌癌变过程中发挥重要作用。

图7 流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡情况Fig.7 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

本研究证实SIAH1在部分乳腺癌组织中存在核表达，提示乳腺癌中存在SIAH1核异位表达蓄积现象。有研究［11］发现SIAH1具有GSNO依赖的核异位表达现象。本研究显示GSNO可以诱导乳腺癌细胞中SIAH1入核，抑制SIAH1表达后这种作用消失。流式细胞仪检测结果表明GSNO可以抑制乳腺癌细胞凋亡，且这一过程与SIAH1核转位有关。因此，进一步研究SIAH1核转位抑制乳腺癌细胞凋亡的分子机制，对深入了解SIAH1生物学功能具有重要的意义。

研究［17］表明转录因子E2F1是细胞增殖和凋亡的关键调节因子，且在肺癌细胞系中E2F1可介导SIAH1的调控机制，本研究结果显示给予乳腺癌细胞GSNO刺激后，细胞核SIAH1蛋白表达增加，而E2F1和Bim蛋白表达均降低，提示GNSO诱导SIAH1核异位后可能降低E2F1和Bim蛋白表达。为进一步研究E2F1/Bim在SIAH1核转位中对细胞凋亡的影响，给予乳腺癌细胞GSNO刺激的同时siRNA干扰E2F1的表达，流式细胞仪检测结果表明处理后的细胞早期凋亡率明显下降，提示GNSO诱导SIAH核异位后抑制乳腺癌细胞凋亡可能是通过下调E2F1来调控的。

综上所述，乳腺癌组织中可出现SIAH1核异位现象。在乳腺癌细胞系中，GNSO诱导SIAH1核异位后可能是通过下调E2F1的表达抑制乳腺癌细胞凋亡，提示SIAH1可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。E2F1/Bim是如何在GSNO诱导的SIAH1核异位表达中发挥作用，具体机制有待于今后进一步探讨。