褪黑素保护卵母细胞应对热应激损伤的研究

杜海燕，王守红，黄薇薇

(内蒙古医科大学第三附属医院 妇产科生殖医学中心，包头 014010)

哺乳动物具有在35～39℃的范围内保持生理功能的能力，恒定的体温对于生物体的正常生理功能十分重要。在持续高温的情况下，动物的身体会对恶劣的环境做出一系列的生理和病理变化，如果温度过高，身体的调节能力就会受到限制。当温度高达41℃时，大多数动物都不能忍受这种压力，生理功能会受到损害[1]。哺乳动物的生殖系统比其他身体部位对温度更加敏感。大量研究表明，热激刺激(heat stress，HS)对哺乳动物精子的生成、卵母细胞的成熟、早期胚胎的发育以及胎儿的生长发育有着严重影响。HS可以通过多种途径导致卵母细胞的成熟障碍，可能影响颗粒细胞中类固醇激素(如LH)的合成[2]；HS能够损伤体外成熟卵母细胞的染色体和细胞骨架，从而降低胚胎发育率[3]。另有研究表明，HS促使猪颗粒细胞凋亡，加速卵泡闭锁，最终显著降低排卵率[4]。随着对凋亡相关基因caspase的抑制，HS对牛胚胎发育潜能的不良影响显著降低[5]。在小鼠卵母细胞中，HS促使活性氧簇(ROS)水平过量表达，降低谷胱甘肽的含量，从而导致氧化应激反应的发生[6]。而氧化应激是危害细胞正常生理功能的最常见因素之一，导致细胞内结构的破坏，最终导致细胞死亡。抗氧化剂可以改善细胞的生存环境，减少HS对细胞的损伤。褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是最有效的氧化剂之一。褪黑素在卵母细胞成熟、排卵和早期胚胎发育等方面，起到重要的作用。研究结果显示，褪黑素可以改善牛卵母细胞的质量，从而提高胚胎的发育率[7]，或许可以成为治疗不孕症的一种新的辅助药物[8]。尽管许多研究已经报道了褪黑素对卵母细胞的体外成熟有促进作用，但是具体机制尚不清楚。本研究通过建立卵母细胞的HS模型，确定HS与卵母细胞成熟受损之间的潜在关系，再通过体外添加褪黑素，探讨在HS下褪黑素促进卵母细胞成熟的作用机制。

材料与方法

一、实验动物

8周龄ICR小鼠购于内蒙古大学SPF级实验动物繁育室，饲养温度22～24℃，湿度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗交替，喂养灭菌营养颗粒饲料，自由采食饮水。本研究所涉及的动物实验均遵照内蒙古医科大学《实验动物管理与使用操作规范》执行。

二、研究方法

1.卵母细胞的收集和体外成熟：使用成年8周龄ICR雌性小鼠，皮下注射10 U 孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后颈椎脱臼处死小鼠，取出卵巢扎破卵巢，取出卵丘-卵母细胞复合体，使用口径合适的玻璃针反复吹吸去除卵丘细胞，置于CZB培养液(Sigma，美国)中，37℃、5%CO2培养箱中培养。2.5 h统计生发泡破裂(GVBD)比率，GVBD率=(发生GVBD的卵母细胞/全部卵母细胞)×100%；14 h统计第一极体排放(PBE)比率，PBE率=(排出第一极体的卵母细胞/全部卵母细胞)×100%。

2.热激处理及药物处理：将卵母细胞随机分成3组，分别是对照组(Ctrl组)、热激组(HS组)和热激+褪黑素组(HS+M组)。褪黑素(Sigma，美国)浓度为1×10-9mol/L[9]。培养滴平衡过夜，对照组卵母细胞置入含2.5 μmol/L米力农(milrinone，Sigma，美国)的CZB培养液中使卵母细胞处于GV期，37℃、5%CO2培养10 h；将HS组卵母细胞和HS+M组卵母细胞置于含2.5 μmol/L米力农的CZB培养液中42℃、5%CO2培养箱热应激10 h。随后将3组卵母细胞同时在微滴中洗掉米力农转入37℃、5%CO2培养箱中成熟培养。

3.纺锤体及染色体荧光染色：收集卵母细胞后，置于台氏液中去除透明带，4%PFA室温固定30 min，0.5% Triton X-100中室温通透1 h，1% BSA室温封闭1 h；一抗anti-β-tubulin(Abcam，美国)1∶2 000，4℃孵育过夜；二抗FITC-Donkey Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美国)1∶1 000室温避光孵育1 h，PI(Sigma，美国)1∶50复染，室温10 min，封片共聚焦显微镜观察，成像。

4.卵母细胞早期凋亡测定：细胞凋亡试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照操作说明书进行检测。Binding buffer 和Annexin-V-FITC比例为10∶1，避光孵育10 min后，在激光共聚焦显微镜下观察、统计并拍照，卵母细胞早期凋亡即卵母细胞膜上存在绿色荧光信号，凋亡率=(存在荧光信号的卵母细胞/全部卵母细胞)×100%。

5.蛋白印迹法检测热休克蛋白70：将收集的卵母细胞加入13 μl裂解液(Bio-rad，美国)后的蛋白样品煮沸5 min，上样于12%的分离胶，电泳恒电压120V，150 min。运用湿转装置，恒电流200 mA，转膜1 h。5%脱脂奶粉封闭2 h。选取目的蛋白的条带位置，分别孵育一抗Anti-Hsp70(Abcam，美国)、Anti-β-tubulin(Abcam，美国)1∶500，4℃过夜孵育。二抗Perox-AffiniPure Dnk Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美国)1∶2 000，37℃，1 h。孵育HRP化学发光底物(Pierce，美国)ECL检测，成像。

三、统计学分析

结 果

一、褪黑素促进热激后卵母细胞的成熟

通过对卵母细胞进行热激处理，并在热激后添加褪黑素体外培养14 h后进行统计。结果表明，与对照组相比，HS组卵母细胞GVBD率与PBE率显著降低(P<0.01)；当在热激后的卵母细胞培养液中添加褪黑素后，与热激组相比，GVBD率(P<0.05)与PBE率(P<0.01)均显著提高，但是仍显著低于对照组(P<0.01)(表1、图1)。

表1 褪黑素对热激后卵母细胞成熟的影响(±s)

注：与对照组比较，*P<0.01；与HS组比较，#P<0.05，†P<0.01

标尺=100 μm图1 不同处理组卵母细胞成熟状况

二、褪黑素改善热激后卵母细胞的纺锤体异常

为了研究褪黑素是如何改善卵母细胞的质量，我们通过免疫荧光染色观察了纺锤体微管情况，发现与对照组相比，热激后的卵母细胞发生了纺锤体的组装异常，从而导致无法使染色体正确排列到赤道板(图2)。通过统计异常的纺锤体的数量，发现与对照组相比，HS组异常纺锤体的比率有显著提高(P<0.01)；当添加褪黑素后，一定程度的改善了纺锤体装配异常，与HS组相比差异显著(P<0.01)，但是并没有恢复到对照组水平(P<0.01)(表2)。

三、褪黑素减少热激后卵母细胞早期凋亡

卵母细胞的早期凋亡情况结果表明，通过热激处理的卵母细胞与对照组相比，显著提高了细胞的凋亡率(P<0.01)；在添加褪黑素后，能够在一定程度上降低HS所致细胞凋亡(P<0.01)(表3、图3)。

红色：染色体；绿色：纺锤体；标尺=20 μm图2 不同处理组MII卵母细胞纺锤体状况(染色体复合体免疫荧光染色)

表2 褪黑素对热激后卵母细胞纺锤体异常率的影响(±s)

注：与对照组比较，*P<0.01；与HS组比较，#P<0.01

表3 褪黑素对热激后卵母细胞早期凋亡的影响(±s)

注：与对照组比较，*P<0.01；与HS组比较，#P<0.01

早期凋亡的信号为卵母细胞膜上的绿色荧光图3 不同处理组MII卵母细胞的早期凋亡状况

四、褪黑素通过HSP70的过表达改善卵母细胞质量

为了研究褪黑素是通过何种机制来改善卵母细胞，我们检测了卵母细胞中热休克蛋白70(HSP70)的表达水平。结果显示，热激后导致HSP70蛋白表达量有所上调，但与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；添加褪黑素导致HSP70蛋白表达量与对照组和HS组相比显著提高(P<0.01)(图4)。

与其他两组比较，*P<0.01图4 不同处理组卵母细胞HSP70蛋白表达情况

讨 论

热激会导致动物生殖系统的氧化损伤，引起细胞功能紊乱，导致细胞凋亡。例如，高温能显著诱导猪卵巢滤泡和颗粒细胞凋亡[10]。人工授精22 h后暴露于42℃持续9 h，造成猪胚胎发育异常[11]。本研究结果表明，HS能显著的影响卵母细胞的GVBD率和第一极体排放率，这与前人的研究结果一致，HS影响卵母细胞的成熟，进而影响胚胎的发育潜能[12]。通过免疫荧光染色，发现HS能够影响在卵母细胞成熟过程中微管的组装，从而使卵母细胞无法正常排出第一极体。本研究还检测了卵母细胞的早期凋亡，发现HS会显著增加卵母细胞早期凋亡的比率，通过添加褪黑素有效地降低了早期凋亡的比率，但是没有恢复到对照组水平。

褪黑素是一种有效的抗氧化剂，褪黑素及代谢产物N1-乙酰基-N2-甲氧基尿胺和N1-乙酰基-5-甲氧基尿胺可以直接清除活性氧，刺激抗氧化酶的产生。此外，褪黑素可以通过螯合过渡金属从而减少羟基自由基的形成，因此，褪黑素可能通过这种机制改善了热应急带来的卵母细胞的成熟障碍。除此以外，有研究表明，HSP70是一种维持细胞内稳定环境和抑制细胞凋亡的多因素作用因子[13]。HSP70通过调节caspase-3和细胞色素C，保护细胞免受凋亡的影响，并在凋亡调控网络的下游发挥作用。高水平的HSP70通过上调SPKH1、BCL-2、SOD1、CAT和CPX4而下调p53，从而帮助卵母细胞存活[14-16]。因此，通过我们的检测结果表明，褪黑素能够改善卵母细胞的质量，可能是通过HSP70的表达上调来保护卵母细胞。

总之，在体外培养条件下，HS会影响卵母细胞的成熟。这可能是由于氧化应激和干扰激素产生引起的，反过来，这又导致了核成熟和细胞周期的停滞。此外，HS可能通过抑制线粒体的正常功能，导致卵母细胞成熟障碍，甚至发生早期凋亡。褪黑素可通过消除ROS和调节类固醇激素的产生而显著促进卵母细胞的成熟[17]。更重要的是，褪黑激素保护线粒体免受应激损伤带来的早期凋亡[18]。此外，卵母细胞可能有一种自我防御机制来提高内源性褪黑激素的产生来改变HSP70的表达。所有这些机制都有助于卵母细胞对抗HS。