宫腔粘连患者月经血中与ECM降解相关因子的表达及意义

章晓乐，迟令侃，张琼，王萍，齐聪*

(上海中医药大学附属曙光医院 1.妇科；2.辅助生殖科，上海 201203)

子宫内膜损伤是宫腔手术或感染损伤子宫内膜基底层，导致上皮、间质细胞再生障碍，新生血管形成受损，子宫内膜难以完成自我修复，严重者往往造成宫腔粘连(IUAs)[1-2]。Salzani等[3]报道人工流产术后子宫内膜损伤发生率高达37.6%，而我国上海2014年的研究报道称58.3%的IUAs患者有宫腔操作史[4]。中重度IUAs分解手术后再粘连率高达62.5%[4]。IUAs的发生与子宫内膜干细胞数量减少甚至缺失、纤维细胞合成大量的细胞外基质(ECM)有关。ECM中胶原蛋白如Ⅰ型胶原α1链(COLIA1)的异常累积，是IUAs形成的主要基础[5]。ECM降解相关的因子有基质金属蛋白酶9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)。目前诊断子宫内膜损伤情况的金标准是宫腔镜下子宫内膜病理活检，检测内膜组织中MMP-9、TIMP-1、COLIA1等指标表达，但内膜活检具有创伤性，患者依从性差，无法在临床上普及使用，而通过非侵入性方法收集月经血则简单易行[6]。诸多研究已经证实，月经血中含有大量子宫内膜细胞[6-7]，故推测取月经血的离心沉淀物替代内膜组织行以上指标检测具有可行性。本文通过前瞻性研究对IUAs患者月经血中COLIA1、MMP-9、TIMP-1表达水平的变化进行观察，并尝试探讨其临床意义。

一、资料与方法

1.研究对象及分组：选择2017年3月至2018年6月在上海中医药大学附属曙光医院妇产科就诊、经宫腔镜明确诊断的IUAs患者30例为IUAs组。IUAs的诊断参考2015年《宫腔粘连临床诊疗中国专家共识》，粘连性质分为膜性粘连、纤维性粘连和肌性粘连；根据分级评分标准9～18分为中度粘连，19～28分为重度粘连。选择同期无性生活、于我院体检的志愿者女性30例作为对照组。两组入组标准：(1)既往月经规律；(2)经阴道或腹部B超监测：无IUAs以外的明显器质性病变；(3)性激素检测正常范围；(4)育龄期妇女(23～35岁)，非高危人工流产患者；(5)近2个月未接受任何生殖激素类药物。本研究经医院伦理委员会批准，研究对象均已签署知情同意书。

2.标本采集：嘱两组女性月经第2天来院取材，有性生活者留取月经血3 ml(于后穹隆内5 ml针筒去针抽取)，无性生活者清洗外阴后，针筒去针抽取自然排出阴道、留置于弯盘内的不含血块的经血3 ml，均放置于抗凝管内保存。加入适量溶血剂，颠倒混匀，4℃ 10 00 rpm离心5 min后，弃上清液，取沉淀组织。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA的表达水平，按照Trizol试剂盒(购自美国赛默飞公司)说明书，提取两组对象的总RNA，检索GenBank数据库目的序列，采用Primer 5.0引物设计与分析软件设计引物(表1)，各标本取2 μg总RNA逆转录成cDNA，并于20 μl反应体系(cDNA2.0 μl，上下游引物各0.3 μl，2×SYBR Green 10 μl，去离子水补足至20 μl)中进行反转录反应。反应在美国ABI Quantstudio5荧光定量PCR仪上进行，结果以MMP-9/β-actin、TIMP-1/β-actin、COLIA1/β-actin值表示。

表1 qRT-PCR引物序列、退火温度及产物长度

二、结果

1.两组对象基本资料比较：IUAs组患者中中度粘连16例，重度粘连14例；患者年龄24～33岁，平均(28.72±4.77)岁，平均体重指数(BMI)(21.94±2.45)kg/m2，月经周期平均(30.17±3.68)d。对照组年龄23～32岁，平均(27.57±4.15)岁，平均BMI(21.67±2.67)kg/m2，平均月经周期(29.93±2.47)d。两组年龄、BMI、月经周期比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表2)。

2.两组对象月经血中MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA表达水平比较：使用qRT-PCR检测MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达水平发现，IUAs组的MMP-9相对表达量显著低于对照组(P<0.05)；TIMP-1的相对表达量两组间比较无显著性差异(P>0.05)；IUAs组MMP-9/TIMP-1的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)(表3)。

表2 两组对象基本资料比较(±s)

表3 两组对象月经血中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达水平比较(±s)

注：与正常组比较，*P<0.05

3.月经血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表达与IUAs粘连特征的关系：在中度及重度IUAs患者月经血中，MMP-9/TIMP-1的相对量分别为(4.59±1.93)、(2.34±1.89)，二者比较有显著性差异(P=0.024)。在膜性、纤维性及肌性粘连中MMP-9/TIMP-1的相对表达量分别为(5.11±1.76)、(3.01±1.57)、(2.27±1.39)，组间比较有显著性差异(P=0.046)；纤维性粘连与肌性粘连组间比较无显著性差异(P>0.05)。膜性、纤维性及肌性粘连中COLIA1的相对表达量分别为(3.44±1.72)、(4.32±1.73)、(6.25±1.34)，组间比较有显著性差异(P=0.041)；膜性粘连与纤维性粘连组间比较无显著性差异(P>0.05)(表4)。提示MMP-9/TIMP-1、COLIA1的表达可能与IUAs的严重程度及粘连性质有关。

表4 不同程度、性质粘连患者月经血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表达水平比较(±s)

注：与重度粘连比较，*P<0.05；与纤维性、肌性粘连比较，aP<0.05；与膜性、纤维性粘连比较，bP<0.05

三、讨论

月经期子宫内膜中的功能层从基底层崩解脱离，内膜与血液混合排出[8]。经血包含月经血液，还含有部分子宫内膜[9]。育龄期女性在月经期子宫内膜调亡剥脱，但在随后的月经周期中内膜能自我完成无疤痕修复。子宫内膜的再生能力暗示子宫内膜可能存在干细胞，其在内膜增殖的动态平衡和再生中起关键作用[10]。故月经血可以成为当今液体活检标本的来源及子宫内膜干细胞库。

本研究将月经血作为研究对象，研究发现，月经血离心沉淀的组织物中，COLIA1随着IUAs程度加重表达增加。大量研究证实：子宫内膜受损后导致纤维化因子大量产生，刺激成纤维细胞合成大量的ECM，ECM合成和降解紊乱，导致ECM过度沉积，纤维粘连形成[5]，尤其是ECM中胶原的异常累积，含量迅速增加，成为纤维化的主要间质，是IUAs形成的主要基础。同时在组织标本的研究中发现，IUAs严重的患者，ECM中COLIA1的异常累积也较多[11]。本研究同样发现，较正常女性，IUAs患者月经血中COLIA1的表达增加，并随IUAs程度的加重表达显著。

众多研究证实MMP-9、TIMP-1主要调节ECM成分的沉积和降解，并且广泛分布于子宫内膜，与子宫内膜周期性增生和剥脱相一致，参与月经发生、内膜重塑、内膜血管修复等[12-13]。其中MMP-9属于明胶酶，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等，还可促进血管基底膜的降解。TIMPs是MMPs活性的天然抑制因子[14]。TIMP的过度表达抑制了MMPs的活性，使ECM降解减少，ECM的合成与降解失衡，致使ECM在子宫内膜组织中聚集，抑制正常子宫内膜组织生长，子宫内膜组织逐渐被纤维结缔组织所取代，导致IUAs形成[15]。我们研究发现IUAs组月经血中的MMP-9显著低于正常组，与成九梅等[16]、尚雪等[17]对子宫内膜标本的研究结果一致。MMPs/TIMPs的平衡是维持ECM内环境稳定和完整的决定因素[18]。本研究发现IUAs组的MMP-9相对表达量和MMP-9/TIMP-1比值显著低于正常组，并且MMP-9/TIMP-1比值随着IUAs程度加重而减少。

综上所述，我们发现IUAs患者月经血中存在与ECM降解相关因子的表达，提示临床上或许可以选用月经血对IUAs程度进行无创评估。但因为研究纳入样本量较少，结果可能存在一定偏倚，后续需进一步扩大样本量加以分析讨论，以期为通过月经血判断IUAs程度及IUAs治疗效果评估等提供实验依据。