青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及其在PolyI：C刺激下的表达分析

侯梓园 石雅峰 姚远 潘宝平 闫春财

摘要[目的]研究青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及在PolyI：C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases）基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因，并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到CsERK基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI：C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]ERK基因序列全长为2407bp，开放阅读框长1338bp，共编码445个氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达，在血淋巴中表达量最高，闭壳肌中表达量最低。青蛤ERK基因在PolyI：C胁迫下表达量在6h时达到最大值，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。

关键词青蛤;ERK基因;PolyI：C;荧光定量PCR

中图分类号S944.4文献标识码A

文章編号0517-6611（2019）01-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.031

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

青蛤（Cyclinasinensis）是一种常见的海产经济贝类，其食用味道好而且具有很高的营养价值，青蛤养殖是我国海产品养殖的支柱型产业，青蛤本身具有重要的药用价值[1]。但是随着近年来我国水产行业大环境的恶化，青蛤在养殖过程中出现了大规模的病害和死亡现象，给近海地区的经济带来了巨大的损失[2]。对青蛤的健康养殖、抗病害机制及免疫调控的研究迫在眉睫，这一研究不仅可以为解决青蛤在养殖过程中出现的死亡现象提供初步的理论研究结果，而且可以为进一步研究青蛤及其他无脊椎动物的免疫方式积累重要的试验依据。

Toll样受体（tolllikereceptors，TLR）是原始且保守的免疫系统受体之一[3]。Toll样受体信号通路主要用于调控一些参与免疫的蛋白表达。细胞外刺激作用于细胞需要通过MAPK信号介导的三级激酶级联反应[4]。而细胞外调节蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）是MAPK家族中的一员，它是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。在脊椎动物中已有ERK基因的相关研究，但ERK基因在软体动物中的相关研究鲜见报道。

聚肌胞苷酸（polyinosinic：polycytidylicacid，PolyI：C）是一种人工合成的双链RNA，可模拟病毒进行试验[5]。作为一种高效的诱导剂，聚肌胞苷酸可在鱼类等海产品及临床医学的小鼠模型研究中作为病毒类似物进行侵染试验。该试验中，通过PolyI：C体外注射得到ERK干扰后的基因，以其为模板测定表达量的变化。

免疫生物学研究是水产养殖中病害防治的理论基础。青蛤只具有先天性免疫系统，而抗生素的使用会使生物产生抗药性。所以，研究贝类免疫相关因子的作用机制在发展水产养殖业中刻不容缓。免疫增强剂的研发和使用将在极大程度上发挥贝类的先天特异性免疫调节功能，大大提高贝类抵御病原体的能力，对水环境保护、贝类增养殖业以及水产品卫生安全等都具有重要的意义[6]。

1材料与方法

1.1材料

青蛤采购于天津王顶堤海鲜品市场，暂养于密度1.02～1.04g/cm3的中性海水中，持续供氧，水温22℃左右[7]，投喂5‰小球藻。饲喂大约7d，选取体表完好、个体形态差别较小的青蛤[平均壳宽（19.12±0.56）mm、平均壳长（29.13±1.22）mm、平均壳高（29.51±1.46）mm]进行分组试验。

1.2方法

1.2.1材料处理。

在注射前选取若干青蛤，提取血淋巴、鳃、肝脏、闭壳肌、外套膜组织约50mg冷冻备用;配置浓度约为1μg/g的PolyI：C[8]。将余下青蛤随机分为试验组和对照组，每组设置3个平行。在试验组青蛤的闭壳肌部位中注射PolyI：C50μL，在对照组青蛤中注射等量灭菌海水。分别在注射后的0、3、6、12、24、48、96h提取青蛤的血淋巴。准确称取各组织50mg，冷冻于液氮中备用。

1.2.2青蛤转录组文库的构建。

将提取的青蛤6个组织于液氮中研磨充分后，置于1mLTrizol中提取组织的总RNA。按照QIAGEN公司的OligotexmRNAKits法分离纯化总RNA。用随机引物逆转录法将纯化后的RNA反转录成cDNA。将得到的cDNA末端修饰、加尾等，用以制备整个文库。采用Unigene编码蛋白框ORF预测分析去冗余后的数据，再经Blast分析后，从中筛选得到青蛤ERK基因类似序列。再利用筛选得到的青蛤ERK基因类似序列进行克隆，设计克隆时所用引物CsERK-F1、CsERK-R1（表1）。

1.2.3生物信息学分析。

基因克隆产物与GenBank中的核酸数据库进行BlastX（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析[9]，利用开放阅读框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线分析软件分析其开放阅读框，使用SignalP3.0分析该基因的信号肽序列，利用SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）预测结构域，ProtParam工具在线预测此序列的分子量、分子式和等电点，使用ClustalW对氨基酸序列进行同源性分析和多重比对[10]。

1.2.4ERK基因在青蛤各组织内的表达。

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