薤白多糖提取、分离提纯及与DNA作用研究

2019-05-14甘杨子钟克焱黄林

生物化工 2019年2期

甘杨子，钟克焱，黄林

（海南医学院，海南海口 571199）

薤白是百合科葱属多年生草本植物，别名小根蒜、小根菜等，广泛分布于东亚地区。薤白是一种药食两用植物，备受中日韩三国人们的喜爱[1]。中医学认为，薤白味辛、苦，性温，无毒，具有理气、宽胸、通阳之功效，常用于心血管疾病组方中[2]。临床研究显示，薤白多糖是薤白的主要有效成分，现代医学研究显示其主要成分为果糖、葡萄糖，相关研究较少。本文探索薤白多糖提取、分离提纯方法，并分析其对DNA作用。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂、实验材料

药剂科自购的产自江苏某地薤白饮片，经鉴定为百合科葱属植物小根葱的干燥麟茎。实验动物清洁级4周龄小鼠，严格遵守动物伦理规定，数量不限。主要仪器：电热恒温鼓风干燥起、台式离心机、紫外线可见光光度计、恒温水浴锅等。试剂：无水乙醇、牛血清白蛋白胨等标准品，吡啶、盐酸羟胺等色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 薤白多糖提取、分离提纯

取薤白鳞茎200 g，经加热回流脱脂，获得薤白粉末156.42 g。参照文献提出的薤白多糖提取优化条件[3]，温度87.2 ℃，水料比12.2 mL/g，提取3次102 min，合并提取浓缩液，加乙醇定容到40%浓度的薤白多糖乙醇溶液。5 000 r/min离心10 min，-40℃冻干得到粗多糖AMP40及上清液，浓缩上清液去乙醇，加乙醇定容到60%乙醇溶液，离心冻干得粗多糖AMP60及上清液，同法操作得粗多糖AMP80及上清液，弃上清液，最终获得粗多糖。参照文献提出的DEAE-52-纤维素交换柱色谱法进行初步的分离纯化，用葡聚糖凝胶色谱法纯化获得的初步多糖[4]。称量Sephadex G-100凝胶干粉，加30倍体积的水，粉碎浴5 h冷却，清洗2～3次，湿法装柱，水平衡处理24 h备用。取DEAT-52纤维素纯化的多糖各20 mg，加2 mL水溶解，湿法上加到SephadeG-100层析柱，洗脱收集各类多糖，在490 nm处吸收值检测各类多糖的含量。样品处理方式分为预处理、过滤、脱色和透析等多种方式，如已经称重的白色干燥薤白粉末需要用80%的乙醇进行2次回流，每次回流时间为2h，以消除小分子糖、苷类及生物碱等物质。过滤过程是对提取液进行减压抽滤的过程。结果显示纯化的薤白多糖AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1得率为69.425%、75.340%、62.692%、82.442%，以葡萄糖作为标准品，绘制总糖含量的线性回归方程，计算AMP80-1的总糖含量最高达到92.561%～99.195%。采用色谱法、紫外光谱分析薤白多糖成分、纯度。多糖含量测定公式为：

多糖含量=c·V·D/W·V1

在上述公式中，c指代样品溶液稀释后所测得的吸光度对应的浓度（μg/ml）;D为样品溶液的稀释倍数；W为样品的质量，V为水提液定容后的体积。下图所示的内容为未经脱色处理的粗多糖色谱图

图1 未经处理的色谱图

如图所示，图中的刻度值为-0.002、0.000、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010与0.012,。横轴为时间，纵轴为峰面积。

1.2.2 DNA影响分析

常规方法分离小鼠股骨BMSCs，将培养的85%BMSC，0.25%胰酶消化吹打后接种到孔板上。将BMSC分为空白组、对照组、实验组（剂量100μL、剂量为12.5、25、50、100 μg/mL）薤白多糖。每个浓度加入6个复孔，培养3日后，弃50 μL的培养基。空白对照组不进行辐射，其余辐射处理，2日1次，每次2 Gy，连续5次。对照组加生理盐水。每次辐射都更换相应培养基，末次辐射前4 h，加4 mL间充质干细胞培养基，37 ℃培养，末次辐射，弃培养基，PBS洗涤1次，胰酶消化1 min，加3 mL胎牛血清终止，吹打均匀，转到EP管中，2 000 r/min离心10 min，弃液体加KCl溶液7 mL混匀，37 ℃水浴50 min，加3 mL固定液混匀，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加5 mL固定液，混匀室温下放置15 min，2 000 r/min离心10 min，加2 mL固定液振荡混匀，4℃保存72 h。预冷载玻片，加BMSC后干燥，姬姆萨染色15 min，清水处理，干燥，高倍镜下观察分析畸变率，用免疫荧光法检测各组细胞+/16( CDE9 ）焦点簇数目，分析DNA损伤。

1.3 观察指标

不同组对象的畸变率、焦点簇数目。畸变率为畸变数量在样本总数中的所占比例。

1.4 统计学处理

SPSS20.0软件统计学计算，不同组对象的畸变率、焦点簇数目多组比较采用F检验，每组两两比较采用t检验。

2 结果

出峰良好，如图2所示，

图2 紫外谱图

根据本次研究的研究结果，AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1均未见吸收峰，提示不含有核酸、蛋白质，提示为单纯的多糖组分，证实多糖中含有阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖。空白组、对照组、不同浓度的薤白多糖溶液处理的实验组的畸变率、焦点簇数目随着薤白浓度的上升呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组畸变率、焦点簇数目低于空白组、对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）见表1。

3 讨论

薤白多糖提取、分离提纯方法基本成熟，本次研究中采用分布沉淀法进行薤白多糖分离提纯后，提取物未见吸收峰，经鉴定多糖中主要成分为阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，与其他文献报道的结果相似[4-5]。

目前有关多糖与DNA的研究主要集中在其对NDA的保护作用，本次研究也显示空白组、对照组、不同浓度的薤白多糖溶液处理的实验组的畸变率、焦点簇数目差异有统计学意义（P＜0.05），提示薤白多糖处理可以降低细胞的畸变率，这可能有助于降低恶性肿瘤发生风险。有报道显示薤白多糖还可以与DNA进行相互作用，水相中的DNA与抗癌药物相互作用，可嵌入到双螺旋DNA的碱基对，形成复合物[6]。该多糖还通过影响磷酸化修饰、抗氧化活性，发挥DNA保护作用。不同类型的薤白多糖对DNA的作用不尽相同，今后还需进行薤白多糖的不同成分研究，以更好的挖掘薤白多糖的药用学价值。

表1 空白组、对照组、不同浓度的薤白多糖溶液处理的实验组的畸变率、焦点簇数目对比（±s）

分组空白组对照组 12.5μg/mL 25μg/mL 50μg/mL 100μg/mL畸变率（%） 18.33±4.93 22.33±4.72 16.56±3.56 15.40±3.41 14.18±3.32 13.08±3.17焦点簇数目（个/100） 265.18±29.46 281.59±45.60 221.10±48.15 190.49±37.24 172.00±35.79 168.58±34.65