西瓜连作对根际微生物群落的影响

聂园军 李瑞珍 赵佳 薄晓峰

摘 要： 为明确根际微生物群落演替变化与西瓜连作之间的关系，调查2014—2016年连续3 a（年）种植西瓜的产量和发病情况，并利用Illumina Miseq平台对连作西瓜根际土壤微生物群落进行扩增子测序分析。结果表明，连续3 a种植西瓜其产量显著降低而枯萎病发病率和病情指数显著提高。不同种植年限根际微生物群落多样性存在显著差异，西瓜的连年种植打破了其根际微生物群落原有的平衡，使得细菌群落多样性下降而真菌群落多样性上升。在门水平上，Proteobacteria、Acidobacteria和Ascomycota的相对丰度升高，而Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes和Chytridiomycota的相对丰度下降。在属水平上，Bacillus，Lysobacter与Pseudomonas等许多有益微生物相对丰度降低而病原菌所在的Fusarium相对丰度增加，最终表现为西瓜枯萎病爆发，产量降低。

关键词： 西瓜； 根际微生物群落； 扩增子测序； 连作障碍

Abstract： Watermelon rhizosphere soil were taken as the experiment objectives， we explored the relationship between rhizosphere microbial communities and continuous cropping. The relationships between yield and disease of watermelon from 2014 to 2016 were investigated. Nine soil samples from three years were sequenced using Illumina Miseq. The continuous cropping decreased the yield， increased the disease incidence and disease index. The diversity of rhizosphere microbial communities in different years were significant difference. The balance of rhizosphere microbial communities was broken because of continuous cropping of watermelon， which resulted the reduction of bacteria community diversity and the increase of fungal community diversity. At the phyla level， the relative abundance of Proteobacteria，Acidobacteria and Ascomycota increased， while the relative abundance of Firmicutes，Actinobacteria，Gemmatimonadetes and Chytridiomycota decreased. At the genus level， some beneficial microbes like Bacillus， Lysobacter， and Pseudomonas decreased and pathogenic microbes （Fusarium） increased. Finally， the Fusarium wilt outbroke and the yield decreased.

Key words： Watermelon； Rhizosphere microbial communities； Amplifier sequencing； Continuous cropping obstacle

我國人均耕地面积较少，经济作物连续多年在同一地块种植的连作模式非常普遍，而多年的连作常引起作物生长受阻、土传病害频发[1-3]。西瓜是世界上重要的园艺作物之一，我国栽培总面积为180.15万hm2，年产量约为7 071.3万 t[4]。枯萎病害是西瓜连作过程中最主要病害之一，它是由尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f. sp. niveum侵染引起的一种土传真菌病害，在西瓜各个生育期都可能发病，尤以坐果期和膨瓜期发病最重[5-7]。枯萎病是连作西瓜产量降低和品质下降的重要原因[8-9]。因此，弄清连作西瓜根际微生物群落演替变化与西瓜生长、病害发生之间的互作关系，是解决西瓜连作障碍的关键。

根际土壤微生物群落是土壤生态系统持续发挥作用的重要媒介，是反应土壤健康状态的重要指标[10]。目前，国内外对根际微生物群落的研究主要集中在细菌群落上，根际真菌群落报道较少，如Ling等[9]研究了西瓜连作条件下施用不同肥料根际细菌群落的变化情况；肖蓉等[11]研究了患炭疽病草莓与健康草莓根际土壤细菌群落的多样性，这些研究没有系统地反映根际微生物群落整体的演替变化。在根际微生物的研究中，基因测序技术已成为主流，对根际的细菌和真菌群落都可以进行系统的分析。扩增子高通量测序技术通过提取根际土壤微生物总DNA，扩增其中的特异性片段并进行测序分析，测序结果由于可精确定位到种属而被科研人员广泛应用[12-13]。郝海婷等[14]利用Illumina MiSeq测序平台研究了堆肥与化肥对兰州百合根际土壤微生物群落的影响，物种注释结果显示细菌的门、纲、目、科、属的数量在施用堆肥的土壤中都大于施用化肥的土壤。扩增子高通量测序技术无需对根际微生物进行培养，具有周期短、精度高的优点，是研究根际微生物群落的有效手段。

笔者以连作西瓜根际微生物群落为研究对象，利用扩增子高通量测序技术从整体上分析西瓜连作过程中根际微生物群落变化情况，并与西瓜产量和病害等因子进行关联分析，找出影响西瓜生长的关键菌群，明晰根际微生物群落演替变化与西瓜连作障碍之间的关系，为克服西瓜连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物：西瓜品种为‘早佳（8424），由山西省农业科学院植物保护研究所提供。

试剂及仪器：美国OMEGA公司E.Z.N.A. Soil DNA Isolation kit试剂盒、琼脂糖试剂盒、 Qubit 2.0 DNA 检测试剂盒，上海派森诺生物科技有限公司。DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂；BG-gdsAUTO凝胶成像仪，北京百晶生物技术有限公司；Illumina Miseq平台测序，上海派森诺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 西瓜连作田间试验及土样采集 2014—2016年在山西省晋中市山西省农业科学院东阳基地进行西瓜连作试验。该试验田从未种植过西瓜，2013年种植作物为玉米。2014年种植西瓜前，试验田土壤有机质含量（w，后同）16.59 g·kg-1，全氮含量1.98 g·kg-1，有效磷含量16.43 mg·kg-1，有效钾含量232 mg·kg-1，pH 7.08。西瓜品种为‘早佳（8424），每年3月25号营养钵育苗，35 d左右2叶1心时移栽到试验田，6月25号左右开始采收；分3个小区，每个小区宽5 m长10 m，小区间隔5 m，面积为50 m2，宽窄行种植，宽行行距2 m，窄行0.5 m，株距0.8 m，常规水肥管理。连续种植3 a，每年种植前每个小区施入10 kg复合肥（mN∶mP∶mK=15∶15∶15）。

每年西瓜收获后，用土钻在每个小区随机选择5处根际土壤每处100 g，采集深度为15～20 cm，均勻地混合为一个样品，然后装密封袋低温带回实验室，去除植物根系和石块并过2 mm筛后于-20 ℃冰箱保存，备用；每年采集3个土壤样品，连续3 a共采集9个样品。

1.2.2 连作西瓜病害调查及产量统计 每年西瓜收获前7 d对试验小区内的所有西瓜植株进行观察，记录枯萎病的发生情况，计算发病率和病情指数[15-16]。发病率=发病株数/总植株数×100%。病害等级划分标准：0级-整株无症状；1级-整株无变黄叶片；2级-1～2个叶片萎蔫；3级-全株>1/3叶片萎蔫；4级-全株>1/2叶片萎蔫；5级-全株>3/4叶片萎蔫或死亡。病情指数=Σ（病害等级×该级对应植株数）/总植株数。每年收获期，各小区西瓜分批全部采收、称量，按小区统计产量。

1.2.3 土壤DNA提取、PCR扩增和高通量测序 利用E.Z.N.A. Soil DNA Isolation kit 试剂盒参照其使用说明书提取土壤样品DNA[17]。对细菌16S rDNA基因V3-V4高变区进行PCR扩增，引物序列分别为341F（CCTACGGGNGGCWGCAG） 和 805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）；对真菌NS1-FUNGAL区域进行PCR扩增，引物序列分别为NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和FUNGAL（ATTCCCCGTTACCCGTTG）[18]。扩增反应程序：94℃预变性5 min；30个循环（94 ℃ 45 s；55 ℃ 30 s（16S）/58.5 ℃ 45 s（18S）；72 ℃ 1 min）；72 ℃ 5 min。对PCR产物进行琼脂糖电泳，并采用琼脂糖试剂盒回收，然后用 Qubit 2.0 DNA 检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，每个处理DNA取10 ng，最后按1∶1等量混合后采用Illumina Miseq平台进行测序[19]。

1.2.4 可操作分类单元聚类与物种分类分析 利用Fast QC软件对测序原始数据进行质量控制，然后拼接、过滤掉低质量的序列，而后基于这些高质量序列进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析，并将 OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs 和分类谱系的基本分析结果[20]。对物种注释后，对门和属的分类水平上对相对丰度大于等于1%的优势物种进行群落结构的统计分析，明晰物种构成。

1.2.5 微生物群落Alpha多样性分析 利用Mothur软件进行微生物群落的Alpha多样性分析，包括稀释性曲线、Chao1指数和香浓指数[21-23]。稀释曲线是从样本中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目，即OTUs 数目，用数据量与物种数所构建的曲线；当曲线趋向平坦时表明样品的测序数据量渐进合理，并间接反映样品中物种的丰富程度。Chao1指数和香浓指数是衡量群落多样性的重要指标，指数越大，群落的丰富度和多样性越高。

1.2.6 土壤样品与环境因子相关性分析 利用冗余分析技术（redundancy analysis，RDA）对土壤样品与微生物群落（门水平）和西瓜病害及产量这些环境因子进行相关性分析[24]。通过RDA分析可将土壤样品与环境因子数据互相拟合，并通过置换检验来判断环境因子与土壤样品、环境因子与环境因子之间的影响是否显著。RDA分析可以将样品和环境因子反映在同一个二维排序图上，从图中可以直观地看出样品分布和环境因子间的关系，确定微生物群落在不同年份的消长变化，明晰显著影响西瓜病害和产量的菌群。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，应用邓肯氏新复极差法检验（Duncans new multiple range tests）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 连作西瓜的枯萎病发病情况及产量

由表1可知，随着种植年限的增加，西瓜的发病率和病情指数逐年上升而产量逐年下降，且不同年份间差异显著。2014年，西瓜的发病率极低仅为2%，产量表现正常。而连续种植3 a后，西瓜枯萎病爆发，发病率与病情指数急速上升，分别达到61.3% 和1.87，而小区产量严重下降仅有102.6 kg，为第1年产量的29%。

2.2 微生物群落分类分析

在门水平，2014—2016年连作西瓜根际土壤微生物群落的优势物种出现消长变化。从细菌群落看，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）是所有样品中相对丰度≥1%的10个优势门，变形菌门与酸杆菌门的相对丰度随着连作年限的增加而逐渐升高，而厚壁菌门、放线菌门与芽单胞菌门的相对丰度随着连作年限的增加而逐渐下降（图版A，见彩色插页第12页）。从真菌群落看，壶菌门（Chytridiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、子囊菌门（Ascomycota）、纤毛菌门（Ciliophora）、担子菌门（Basidiomycota）、丝足菌门（Cercozoa）、球囊菌门（Glomeromycota）与罗兹菌门（Rozellomycota）是所有样品中相对丰度≥1%的8个优势门，其中子囊菌门的相对丰度在3 a中均在70%以上，超过其它微生物群落之和，处于支配地位。随着连作年限的增加，子囊菌门的相对丰度逐渐升高，而壶菌门的相对丰度逐渐降低（图版B，见彩色插页第12页）。

在细菌属水平，相对丰度处于前10位的优势属中，在连作3 a后芽孢杆菌属（Bacillus）、红游动菌属（Rhodoplanes）、溶杆菌属（Lysobacter）、土壤红杆菌科（Solirubrobacter）、德沃斯氏菌属（Devosia）与假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度处于最低值；而浮霉菌属（Planctomyces）和丰祐菌属（Opitutus）的相对丰度处于最高值（图版C，见彩色插页第12页）。在真菌属水平，相对丰度处于前10位的优势属中，在连作3 a后尖孢镰刀菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）与疣孢漆斑菌（Myrothecium）的相对丰度处于最高值；而红根菌属（Rhizophlyctis）的相对丰度处于最低值。最重要的是，西瓜枯萎病病原菌所在的尖孢镰刀菌属，连作3 a后相对丰度最高（图版D，见彩色插页第12页）。

2.3 连作西瓜土壤微生物群落的多样性分析

2.3.1 稀释曲线分析 9个样品中，细菌16S rRNA序列总数为436 187（45 603-64 320）；真菌NS1–FUNGAL序列总数为310 734（25 341-83 499）。土壤样本细菌和真菌随着序列数的增加的稀释曲线均趋于平缓，说明测序量已经基本覆盖到样品中所有的物种。随着种植年限的增加西瓜根际土壤中细菌群落的OTUs显著降低（图1-A）；与之相反真菌群落的OTUs随着种植年限的增加而升高（图1-B）。

2.3.2 Chao1指数和香浓指数分析 连作西瓜根际土壤样品中细菌的Chao1指数和香浓指数总体上均高于真菌，细菌在土壤微生物中占主体地位，微生物群落Chao1指数和香浓指数因种植年限不同而产生显著差异；细菌群落的Chao1指数和香浓指数随种植年限的增加而显著降低，在连作3 a后达到最低值（4 254.817和8.857）；而真菌群落的Chao1指数和香浓指数随种植年限的增加而显著升高，在连作3 a后达到最高值（641.462和6.246）。西瓜根际土壤中的细菌和真菌群落多样性随连作年限的增加呈现此消彼长的趋势（表2）。

2.4 土壤样品与环境因子相关性分析

将样品、环境因子进行关联分析（图2），不论细菌类群还是真菌类群，不同连作年限的样品各自分开，产量与2014年的3个样品呈正相关，而与2016年的3个样品呈負相关；发病率和病情指数的结果与之相反。从细菌类群看，厚壁菌门、Actinobacteria和Gemmatimonadetes及产量因子和2014年的3个样品呈正相关，而与发病率、病情指数、2016年的3个样品呈负相关；Proteobacteria、Acidobacteria和Planctomycetes的结果与之相反。从真菌类群看，Chytridiomycota和Glomeromycota及产量因素和2014年的3个样品呈正相关，而与发病率、病情指数、2016年的3个样品呈负相关；而Ascomycota、Ciliophora、Basidiomycota和Cercozoa的结果与之相反。

3 讨 论

根际土壤微生物群落是反应土壤健康状况的重要指标之一，不同的农业耕作模式会影响根际土壤微生物多样性甚至作物的生长[25-26]。西瓜连作对土壤的影响同样反应在根际微生物群落的变化上。从西瓜根际微生物门、属水平物种分类上看，所有土壤样品中的物种类群大体相似但在相对丰度上差别很大，Li等[8]在番茄的研究中也有类似报道。这说明种植的作物或农艺条件不同对微生物的物种类群的影响不显著，但对物种相对丰度的影响尤为显著。如：Bacillus、Lysobacter与Pseudomonas的相对丰度随着连作年限的增加而迅速降低，而西瓜枯萎病病原菌所在的属Fusarium随着连作年限的增加而迅速累积。Bacillus能分泌多抗菌物质来拮抗土传病原菌，从而保护植株不受侵害[27-28]。Lysobacter也被证明有拮抗病原菌和促进植株生长的作用[29]。Rumberger等[30]报道，Pseudomonas与植株生长密切相关。因此，可以确认Bacillus、Lysobacter与Pseudomonas这些有益微生物相对丰度的降低和Fusarium相对丰度的升高，与西瓜枯萎病害的发生呈正相关。

通過对稀释性曲线、Chao1指数和香浓指数的分析发现，西瓜根际微生物群落中细菌群落占优势地位，但随着连作年限的增加呈现细菌群落多样性降低而真菌群落多样性升高的现象。这说明微生物群落结构有从细菌性向真菌性转变的趋势。这一现象在很多研究中得到确认，如Luo和Shen等[31-32]发现细菌群落多样性与连作年限成反比，而真菌群落多样性与连作年限成正比。本试验亦证明了低丰度的细菌群落多样性和高丰度的真菌群落多样性与西瓜枯萎病害呈正相关。

冗余分析说明西瓜根际微生物类群的演替变化与连作年限、病害发生和产量情况息息相关。Proteobacteria、Acidobacteria和Ascomycota相对丰度的增加会抑制西瓜生长，使得枯萎病病情逐年恶化；与之相反Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes和Chytridiomycota这些菌群的存在会促进西瓜生长，抑制病害发生。这再次证明了在连续种植西瓜这一外界刺激影响下，根际微生物群落发生了定向改变，某些有益微生物减少而土传病原微生物增加了，而这种变化也影响到了西瓜的农艺性状，使得连作状态下西瓜病害爆发、产量下降，而连作状态下的黑椒和桃等作物都有相似的报道[33-34]。以上结果提示我们，增加土壤中有拮抗作用或促生作用的有益微生物含量，抑制病原菌的生长，使微生物群落结构由“真菌型”转变回“细菌型”，是减少枯萎病危害的有效途径。

本研究明确了西瓜根际促生抑病功能菌群的物种定位，为筛选功能菌株提供了思路。在今后的研究中，应进一步缩短采样时间间隔，更加精确的分析西瓜连作过程中微生物群落的动态变化，从而为克服西瓜连作障碍提供理论依据。

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