番茄抗TYLCV分子标记辅助聚合育种

侯富恩 郝科星 张涛 苏东涛 王铭

摘 要： 为了培育对TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）抗性稳定持久、园艺性状优良的番茄品种，以分别含有Ty-1、Ty-2、Ty-3的3个抗源材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164为供体亲本，2个园艺性状优良的不含抗病基因的育种材料‘TMX255-1‘TMX255-5为受体亲本，通过杂交和多代回交自交，同时利用分子标记辅助选择技术、苗期接种技术和农艺性状观察对后代进行筛选，将Ty-1与Ty-2导入并聚合到‘TMX255-1，Ty-1与Ty-3导入并聚合到‘TMX255-5，最终获得2份聚合了不同抗病基因的株系，分别命名为‘TY1-2‘TY1-3，并对其进行了抗性评价，结果显示，2份株系对TYLCV整个生育期在田间都表现抗病，且园艺性状优良稳定，可以作为自交系应用于抗病育种中。

关键词： 番茄； TYLCV； 分子标记； 聚合育种

Abstracts： In order to breed tomato varieties with excellent resistance to TYLCV （Tomato yellow leaf curl virus） and good horticultural traits， two TYLCV susceptible tomato lines ‘TMX255-1，‘TMX255-5 were used as recipient parents to cross and backcross with the three donor parents ‘TY52，‘CLN2777A，‘R1164，which contained Ty-1，Ty-2，Ty-3，respectively. Molecular marker-assisted selection（MAS）， seedling inoculation identification and observation of agriculture characters were used in each backcross and self-cross progeny selection， and two pyramided lines were obtained which named ‘TY1-2 and ‘TY1-3. The evaluation of resistence level of two pyramided lines showed that the pyramided lines which carried both resistance genes were resistant to tomato leaf curl disease throughout its life cycle in the field and exhibited excellent horticultural traits. So the lines could be used as inbred lines in resistance breeding.

Key words： Tomato； TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）； Molecular marker； Pyramid

番茄黃化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是目前我国番茄生产上的重要病害之一，植株感病后会表现出叶片卷曲、黄化、生长停滞等现象，严重时会导致大面积绝收[1-6]。导致该病发生的病原为番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），该病毒属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA植物病毒，其基因组重组发生率和变异频率较高[7]。利用分子标记辅助选择技术聚合多个抗TYLCV基因，是培育具有持久抗性品种最有效的策略[8]。因此，笔者结合苗期接种鉴定、分子标记辅助选择和田间性状观察，初步研究番茄不同抗TYLCV基因聚合后抗性表现的差异，建立番茄抗TYLCV聚合育种的分子标记辅助选择体系，以获得抗性高且不再分离同时性状优良的自交系，为番茄优质、抗病育种创制新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

3份含有TYLCV抗性基因材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164（分别含有Ty-1、Ty-2、Ty-3），其中‘TY52‘CLN2777A由亚洲蔬菜研究发展中心提供，‘R1164由杂交品种的分离后代选育而成。2份受体亲本材料‘TMX255-1‘TMX255-5（不含TYLCV抗性基因），是由山西省农业科学院农业资源与经济研究所自主选育的纯合自交系。感病对照为‘Moneymaker，该品种在山西地区对TYLCV表现为高感。

1.2 接种鉴定

病毒接种采用大田自然接种法，试验于2012—2017年在山西省农科院榆次东阳温室试验基地进行，1年2代。6—10月份为烟粉虱发病高峰季节，这期间在发病严重的温室内育苗，使植株在苗期感染TYLCV，同时控制虫口数量，7～10 d喷1次杀虫药，以免对植株造成伤害。定植时选择TYLCV发病严重的温室，同样也需注意虫口数量，定期喷施杀虫剂。参照L. Mejía和R. E. Teni等[9]定植30 d和60 d后进行病情调查，根据发病情况对所有植株病情严重指数（disease severity index，DSI）进行统计，统计结果按照发病严重程度分为0～4级：0级，无任何感病症状；1级，顶端叶边缘黄化；2级，顶端小叶变黄并发生轻微卷曲；3级，大范围叶片变黄，卷曲严重，植株生长量小；4级，症状非常严重，植株矮化，基本停止生长[10]。

1.3 抗TYLCV基因聚合过程

2012年种植所有亲本材料‘TMX255-1‘TMX255-5‘TY52‘CLN2777A‘R1164，按计划配制杂交组合，获得（‘TMX255-1בTY52）F1，（‘TMX255-1בCLN2777A）F1，（‘TMX255-5בTY52）F1，（‘TMX255-5בR1164）F1，2012年下半年开始，将获得的F1分别回交，每一代都利用分子标记检测，同时结合农艺性状观察，在回交后代中筛选含有抗病基因的优良单株留种并继续回交。在连续回交6代后，遗传背景基本恢复，2015年下半年将2个方向的回交后代进行杂交，从杂交后代中筛选同时含有2个抗病基因的单株自交并留种，再从自交后代中筛选同时含有2个抗病基因，且纯合的单株进行留种，并对后代进行性状调查，筛选性状与轮回亲本一致的植株留种，继续自交留种，最终于2017年下半年获得2份分别聚合了Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3，遗传背景分别与轮回亲本‘TMX255-1‘TMX255-5基本一致，且高抗TYLCV的番茄品系，分别命名为‘TY1-2‘TY1-3。

1.4 分子标记检测

用于检测与抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的分子标记均为共显性SCAR标记，分别为P6-6、T0302、P6-25[11-13]；所有引物由上海英骏生物技术公司合成，引物序列见表1。PCR反应体系：模板1.5 μL，Taq PCR Master Mix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2.5 μL；反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，退火53 ℃[57 ℃（T0302）]30 s，72 ℃ 45 s ，35个循环，72 ℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 园艺性状指标调查

评价材料遗传背景的主要农艺性状包括：下胚轴颜色、生长习性、茎叶茸毛、叶片类型、叶片形状、叶色、叶裂刻、花序类型、花柱长度、花柱形状、花色、花梗离层、成熟前果色、成熟果色、果面棱沟、果面茸毛、果顶形状、果肩、商品果果形指数、果形、果肉颜色、胎座胶状物质颜色、心室数、可溶性固形物含量、单果质量、种子千粒重。其中，茎叶性状指标在第3穗果成熟期调查统计，花序性状指标在第2花序盛开期调查，果实性状指标在第2穗果成熟期进行调查，各指标采用5个果实的平均值；利用糖度计测量果实的可溶性固形物含量。

1.6 数据分析

利用Microsoft Excel 2010及SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同材料田间烟粉虱接种鉴定后的抗病性表现

单个不同抗病基因及不同抗病基因聚合植株的病级统计结果见表2，定植30 d后进行病情调查，只有感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和对照材料出现病症，单基因抗源材料除了‘TY52（只含有Ty-1）有轻微感病症状外，其余单基因抗源材料和聚合基因材料都无发病症状。定植60 d后，感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和对照材料均表现为严重感病，植株生长停滞，叶片严重黄化卷缩；单基因抗源材料‘TY52表现轻微感病，新叶表面轻微黄化，无皱缩；其余材料均无明显感病症状，均表现为高抗。结合苗期接种鉴定与分子标记检测，选择表现高抗且分别含有抗病基因组合Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3的聚合单株自交留种，再自交，获得2份聚合材料。获得的2份聚合株系整个生育期都表现高抗TYLCV，且农艺性状稳定一致，可以作为自交系用于育种工作。

2.2 聚合后代主要农艺性状观察

通过田间农艺性状统计调查，结果显示聚合自交系‘TY1-2和‘TY1-3在叶、花、果等农艺性状方面与受体亲本已无显著差异（表3）。

2.3 分子标记鉴定聚合材料抗性基因

利用与抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3连锁的分子标记P6-6、T0302、P6-25筛选‘TY1-2‘TY1-3的聚合单株，其中含有Ty-1和Ty-2的‘TY1-2聚合单株能扩增出530 bp和900 bp的特异片段，含有Ty-1和Ty-3的‘TY1-3聚合单株能扩增出530 bp和450 bp的特异片段。从‘TY1-2的148个单株中随机抽取7株进行抗病基因Ty-1（图1-A）和Ty-2（图1-B）的分子标记检测。从‘TY1-3的92个单株中随机抽取7株进行抗病基因Ty-1（图1-C）和Ty-3（图1-D）的分子标记检测。结果显示，抽取的单株中均分别含有Ty-1和Ty-2、Ty-1和Ty-3抗病基因。

3 讨 论

3.1 抗性基因聚合對后代抗病性的影响

通过对含有不同单个抗病基因的材料和2份聚合材料‘TY1-2‘TY1-3进行田间TYLCV接种鉴定，结果表明，聚合了多个抗病基因的材料抗病性显著强于只含有单个抗病基因的材料，同时也证实P6-6、T0302、P6-25分子标记辅助选择聚合育种的有效性。

3.2 分子标记在聚合育种中的作用

用传统的育种方法要实现将多个抗性基因聚合在一起是相当困难的，不仅费时费工，而且很难对多个抗性基因进行检测和鉴定。采用分子标记辅助选择技术对目标基因直接选择，可以很大程度上减少选择的盲目性，提高育种效率，加快育种进程。

本研究中应用的3个分子标记，P6-6、T0302和P6-25，在应用过程中，扩增条带稳定，但遗传距离较大，在后代选择过程中，P6-6的准确率为84.5%，T0302的准确率为89.8%，P6-25的准确率为83.2%。所以分子标记辅助选择必须与田间抗性鉴定相结合，才能达到预期目标，不能单纯依靠分子标记进行筛选。此外，还需要继续开发新的更加紧密连锁的分子标记，以期进一步提高分子标记选择的准确率。

3.3 回交后代的选择

关于回交后代选择的评价指标主要有性状指标和分子标记检测指标[14]。笔者选用综合性状优良的番茄自交系‘TMX255-1和‘TMX255-5作为抗性基因受体亲本，先分别单向回交6代，同时每一代都应用分子标记对目标基因进行选择，使回交后代的遗传背景恢复至近于轮回亲本，且同时含有相应抗病基因。当遗传背景得到一定程度恢复后，再将2个方向的回交后代杂交，从聚合杂交后代中获得遗传背景近于轮回亲本的抗病植株。在定向转移抗病基因Ty-1、Ty-2时，其供体亲本‘TY52‘CLN2777A与受体亲本‘TMX255-1和‘TMX255-5间的遗传背景差异较大，回交后代性状向轮回亲本恢复的速度相对较慢，其BC6 世代综合性状与轮回亲本仍有一定差异。下一步计划筛选出多态性好的分子标记，应用于回交后代性状的恢复过程中，一定程度上提高回交后代的遗传背景恢复速率。

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