碳量子点的制备及其在半胱氨酸比色测定中的应用

文辉忠 梁英彩 肖程月 邱子情 李娟

摘 要 以荔枝皮为原料制备碳量子点（CQDs），此CQDs具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2氧化3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）产生显色反应，而半胱氨酸（CySH）能还原TMB的氧化产物（ox-TMB）使其褪色。基于上述原理，建立了以CQDs为类过氧化物酶的CySH测定方法。以TMB为底物，考察了pH值和温度等因素对CQDs催化性能的影响。实验结果表明，当TMB浓度为0.25 mmol/L时，在pH=3.5、反应温度40℃、反应时间10 min、 0.5 mmol/L H2O2及 0.5 μg/mL CQDs等条件下，体系吸光度的减少值（ΔA）与半胱氨酸浓度在0.05～4.00 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.02 μmol/L（3σ/k）。血清中的常见氨基酸不干扰测定，实际血清样品中半胱氨酸的加标回收率为94.0%～104.0%。

关键词 碳量子点; 模拟酶; 半胱氨酸

1 引 言

半胱氨酸（CySH）是组成人体蛋白质的氨基酸中唯一具有巯基的氨基酸，它是生物体内的还原剂，参与蛋白质和谷胱甘肽的合成，具有保护细胞免受毒物损害等功能，是与疾病相关的一种重要的生理调节因子[1～3]。因此，对半胱氨酸含量进行分析测定具有重要意义。目前，有关半胱氨酸含量的测定方法主要有高效液相色谱法[4]、气相色谱-质谱联用法[5]、毛细管电泳法[6]、荧光法[7]及电化学法[8]]等。这些方法具有选择性好、灵敏度高等优点，但需要昂贵的仪器或冗长的样品预处理、复杂的操作过程。因此，发展简单、快速、廉价的半胱氨酸测定方法很有必要。近年来，随着纳米科学和纳米技术的不断发展，纳米材料在分析测定中的应用日益广泛。基于金或银纳米粒子团聚后发生颜色变化的光度分析法已應用于半胱氨酸的定量测定[9，10]。研究表明，贵金属纳米颗粒或金属氧化物纳米颗粒具有类过氧化物酶特性，可催化H2O2氧化3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）产生显色反应; 而半胱氨酸分子结构中含有巯基，具有较强的还原性，能还原TMB的氧化产物（ox-TMB）使其褪色，从而引起吸光度降低[11]。基于上述原理，研究者开发了以金纳米簇[12]、Fe3O4纳米纤维[13]及NiO纳米花[14]等为类过氧化物酶的半胱氨酸测定新方法。

碳量子点（CQDs）是一种新型纳米材料，具有成本低、荧光发射强度高、毒性低及生物相容性好等优点，在化学分析[15， 16]和生物传感[17， 18]等研究领域得到了广泛应用。2011年，Shi等[19]发现从蜡烛烟灰制备的CQDs具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2氧化TMB产生显色反应，开创了CQDs应用于H2O2及葡萄糖测定研究的新领域。近年来，类似研究屡见报道，如Lin等[20]制备氮掺杂的CQDs用于H2O2及葡萄糖的测定; Wang等[21] 以鸭血为原料，制备多元素掺杂的CQDs用于葡萄糖的比色测定。本研究以荔枝皮为原料制备CQDs，此CQDs具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2氧化TMB产生显色反应; 而半胱氨酸能还原TMB的氧化产物（ox-TMB）使其褪色[11]。基于上述原理，发展一种以CQDs为类过氧化物酶的半胱氨酸测定方法，并应用于实际样品分析。与其它来源的类过氧化物酶相比，以丢弃的荔枝皮为原料制备的CQDs类过氧化物酶具有成本低、催化活性强和稳定性高等特点。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UV-4802型紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）; H1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）; DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）; Nicolet iS5傅立叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）; RF-5301型荧光分光光度计（日本岛津公司）;  Tecnai G2 F20 S-Twin透射电镜 （美国FEI 公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 CQDs的制备 将洗净烘干后的荔枝皮置于坩埚中，用电炉碳化后磨碎; 粉末用丙酮洗涤3次，干燥后，得碳粉。CQDs的制备参照文献[22]方法并略有改动：称取0.5 g干燥碳粉，加入到150 mL 5 mol/L HNO3溶液中， 在140℃下回流12 h; 然后，用Na2CO3溶液调节至pH 7.0，在去离子水中透析2天。在透析后的溶液中加入丙酮，在16000 r/min下离心15 min; 弃去上清液，固体沉淀在真空干燥箱中干燥，准确称重，分散于去离子水中，用离心超滤管超滤除去大颗粒，得棕色CQDs溶液; 最后，用去离子水稀释得到50 μg/mL CQDs溶液，于4℃保存， 备用。

2.2.2 半胱氨酸的测定 在10 mL比色管中，依次加入0.5 mL 5.0 mmol/L TMB、1.0 mL 5.0 mmol/L H2O2、0.1 mL 50 μg/mL CQDs、1.0 mL CySH溶液，充分混合，用0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲溶液（pH=3.5）定容至 10 mL， 在40℃水浴中反应10 min，测定吸收光谱，记录652 nm处的吸光度值（A）。同样条件下做不加CySH的试剂空白（A0）实验，计算吸光度差ΔA=A0- A。

3 结果与讨论

3.1 CQDs的表征

由CQDs的透射电镜图（图1A）可见，制备的CQDs分散性好，颗粒呈球状，粒度分布均匀，主要分布在2～5 nm范围内，平均直径为3.1 nm。图1B中， 0.21 nm的晶格间距与石墨的（100）晶面相符[23]。图1C是不同激发波长下CQDs的荧光发射光谱，当激发波长从360 nm逐渐增加到500 nm时，CQDs的荧光发射峰从470 nm红移至550 nm，呈现明显的激发依赖的荧光特性，与文献[24，25]报道的结果一致。图1D为CQDs的红外光谱图， 3367和1396 cm1处分别出现OH的伸缩振动和弯曲振动峰，1130和1608 cm1处分别出现CO和CO的伸缩振动峰[26]， 表明CQDs表面含有亲水基团OH和COOH， 保证了CQDs良好的水溶性。

3.2 CQDs的催化活性及CySH的测定原理

在pH=3.5的HAc-NaAc缓冲溶液中，以TMB为显色底物，考察了CQDs的催化活性及CySH对显色反应的影响。由图2可见，当溶液中只有H2O2和TMB 存在时，溶液颜色接近无色，对应的吸收光谱在652 nm 处有一个弱吸收峰（图2a），说明H2O2能使TMB发生微弱的显色反应; 当H2O2和TMB混合溶液中存在CQDs时，体系颜色为深蓝色，对应的吸收光谱在652 nm处有氧化态TMB （ox-TMB）的特征吸收峰（图2b），说明所制备的CQDs具有类过氧化物酶的催化特性，能够催化H2O2 氧化TMB 产生显色反应。其原因可能是CQDs表面带负电荷，而TMB在pH=3.5的酸性介质中带正电，可通过静电作用吸附于CQDs表面。由于CQDs良好的电子转移能力，TMB氨基上的孤对电子可通过CQDs转移给H2O2，即CQDs可以加速电子供体TMB 与电子受体H2O2之间的电子转移，提高H2O2的分解速率[27]。在H2O2、TMB和CQDs混合溶液中加入CySH后，体系颜色变浅，652 nm处的特征峰吸收波长不变，但吸收强度降低（图2c），这是因为CySH具有较强的还原性，能还原ox-TMB使其褪色[11]。进一步研究表明，652 nm处的吸光度随CySH浓度的升高而降低（图2d）。据此可建立一种通过吸光度变化（ΔA=A0- A）测定CySH浓度的分析方法。

3.3 反应条件的优化

考察了溶液的pH值、反应温度等条件对CQDs 类过氧化物酶催化活性的影响，并对反应时间及H2O2的浓度进行了优化（图3）。H2O2氧化TMB的顯色反应都是在酸性条件下进行[28～31]，因此首先考察了不同pH值的酸性缓冲溶液（HAc-NaAc）对反应体系ΔA值的影响（图3A）。实验结果表明，CQDs类过氧化物酶活性的最适酸度为pH=3.5。反应温度对CQDs催化活性的影响见图3B， 40℃时CQDs的催化活性最高。如图3C所示，在40℃的水浴中反应8 min后，ΔA趋于稳定，因此选择混合反应10 min后测定体系的吸收值。由图3D可见，H2O2浓度在0.5～0.6 mmol/L范围内时，ΔA值大且稳定，因此选择H2O2的浓度为0.5 mmol/L。

3.4 方法的分析性能及样品分析

当CySH的浓度为3.0 μmol/L时，分别考察了浓度均为30 μmol/L的甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）等常见氨基酸对分析结果的影响。因其它氨基酸分子中不含巯基，不能将ox-TMB还原，对分析结果几乎没有影响（图4），说明本方法检测CySH的选择性良好。

在优化的实验条件下，测定不同浓度CySH存在时体系的响应信号。由图5可见，随着CySH浓度的增加，体系在652 nm 处ox-TMB的特征吸收峰波长不变，吸收强度逐渐减弱; 当CySH浓度在0.05～4.00 μmol/L范围内时，与ΔA呈良好的线性关系，回归方程为ΔA=0.1569C （μmol/L） + 0.051，相关系数R2=0.993，方法检出限（3σ/k）为0.02 μmol/L。表1列出了以不同材料为类过氧化物酶的半胱氨酸检测方法的分析性能，可见本方法的检出限较低，线

4 结 论

以荔枝皮为原料制备了CQDs， 基于CQDs的类过氧化物酶特性，可催化H2O2氧化TMB产生显色反应及CySH能还原TMB的氧化产物（ox-TMB）使其褪色的原理，建立了一种以CQDs为类过氧化物酶的CySH测定方法。本方法选择性好，灵敏度高，应用于血清中CySH的测定，效果良好。本研究不仅为具有催化活性的CQDs的制备提供了一种有效方案，也为进一步拓展CQDs的应用提供了新思路。

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