褐藻多糖硫酸酯对MPP+损伤的MN9D细胞氧化应激及凋亡的保护作用

梁志刚 孙旭文 刘竹丽

[摘要] 目的 探讨褐藻多糖硫酸酯（FUC）对帕金森病（PD）细胞模型的保护作用及机制。 方法 采用100 μmol/L MPP+损伤的MN9D细胞制作PD模型，用MTS检测FUC预处理后PD细胞模型的细胞存活率。荧光检测法测定细胞内活性氧（ROS），荧光素酶法检测细胞内Caspase-3的活性变化，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的变化。 结果 FUC 100 μmol/L作用24 h明显增加了MPP+损伤的MN9D细胞存活率，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;FUC预保护明显降低了MPP+损伤3 h的MN9D细胞内ROS活性及6 h时Caspase-3的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;FUC、司来吉兰预保护后MN9D细胞凋亡相关蛋白Bax表达明显下降，而Bcl-2表达明显增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 褐藻多糖硫酸酯可能通过抗氧化、降低Caspase-3表达、抑制细胞凋亡来保护PD细胞模型。

[关键词] 褐藻多糖硫酸酯;帕金森病;MN9D细胞;氧化应激;细胞凋亡

[中图分类号] R742.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（a）-0020-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect of fucoidan （FUC） on the cell model of Parkinson′s disease （PD） and its mechanism. Methods PD model was established by MN9D cells which were damaged by 100 μmol/L MPP+. The cell viability of PD cell model was detected by MTS after FUC pretreatment. The reactive oxygen species （ROS） was measured by fluorescence detection， the activity of Caspase-3 in cells was measured by luciferase， the expression changes of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were measured by Western blot. Results After application of 12 h， FUC 100 μmol/L significantly increased the cell viability of MN9D cells damaged by MPP+， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The FUC pretreatment reduced the activity of intracellular ROS of MN9D cell damaged by MPP+ in 3 h and the expression of Caspase-3 in 6 h， there were highly statistically significant differences （P < 0.01）. After FUC and Selegiline pretreatment， the expression of MN9D cell apoptosis-related protein Bax was decreased， and the expression of Bcl-2 was increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Fucoidan may protect the PD cell models through anti-oxidation， reducing the expression of Caspase-3 and inhibiting cell apoptosis.

[Key words] Fucoidan; Parkinson′s disease; MN9D cell; Oxidation stress; Cell apoptosis

帕金森病（PD）是一种常见于中老年的中枢神经系统变性疾病，目前其确切发病机制尚不清楚。研究认为氧化应激与细胞凋亡在PD的发病中起重要作用[1]。褐藻多糖硫酸酯（FUC）是从褐藻中提取的具有抗氧化、抗凝及抗老化作用的多糖。研究表明，FUC具有对阿尔茨海默病（AD）模型的神经保护作用[3]，我们推测FUC对于PD亦可能具有一定作用。本研究通过MPP+损伤小鼠中脑多巴胺能细胞系（MN9D）细胞制作PD细胞模型，观察FUC对细胞模型氧化应激及凋亡的影响，以探讨其对PD模型的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

MN9D细胞（购自中国医学科学院，本院中心实验室保存）;DMEM/F12培养基（美国Gibco BRL公司产品，11320-033）;新生牛血清（NCS，奥地利PAA公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MPP+ idione（美国Sigma公司）;FUC（中国生物檢验中心，纯度99.8%，Z20030 053）。阳性对照药物司来吉兰（SEL，芬兰奥立安公司，H20040400）[4]。MTS细胞活力测定试剂盒（G1112）、Caspase-3活性荧光素酶检测试剂盒（PROMAGE公司，G8090）;细胞内活性氧（ROS）荧光检测试剂盒（Cell Biolabs公司，K936）;小鼠单克隆Bax（B8249）和Bcl-2（SAB4500003）抗体、GAPDH（G9545）购自Sigma公司。其他试剂均为分析纯（购自Sigma公司）。

1.2 细胞培养、PD细胞模型建立及实验分组

从液氮罐中取出冻存MN9D细胞管，迅速放入37°C水浴后，离心半径13 cm，1000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀物用DMEM/F12+10% NCS培养液混悬，吸出细胞悬液，用适量培养液稀释后，转入无菌培养瓶37°C、5%CO2细胞培养箱培养，次日更换培养液，细胞培养48 h进入指数生长期后进行传代培养并进行试验。将MN9D细胞接种于Poly-L-lysine包被的96孔板，接种密度为1×105/mL，每孔接种体积为100 μL。细胞稳定培养24 h后更换含5% NCS的DMEM/F12培养基。不同浓度（0、50、100、200、300、400 μmol/L）的MPP+损伤MN9D细胞12～48 h后观察细胞存活率，筛选出最适浓度（100 μmol/L）MPP+，制备PD细胞模型;细胞接种于96孔板培养24 h，分别加入不同浓度（1、10、100 μmol/L）的FUC预保护1 h后，加入100 μmol/L的MPP+作用24 h，对照组加入相同体积的生理盐水，MTS法检测细胞存活率，筛选出FUC最有效的神经保护浓度。然后将细胞用简单随机分组法分为对照组、模型组（MPP+ 100 μmol/L）、FUC组（FUC 100 μmol/L+MPP+）、SEL组（SEL 10 μmol/L+MPP+）。各组分别在MPP+作用3 h时观察ROS的活性，并在6 h时进行Caspase-3活性及细胞内凋亡相关蛋白表达的测定，24 h分别进行细胞活力和形态学检测。

1.3 细胞存活率及细胞内ROS、Caspase-3的检测

细胞接种于96孔板培养24 h，分别加入FUC预保护1 h后，加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，对照组仅加入相同体积的生理盐水，吸取培养液，更换含5% NCS的DMEM/F12培养基，96孔板内每孔加入10 μL MTS试剂细胞培养箱孵育1 h后，加入MTS溶液10 μL/孔，放入CO2孵箱，5%CO2，37℃孵育1～2 h。用酶标仪（490 nm波长）测OD值，分别把模型组及不同浓度FUC组OD值/对照组OD值，比值计数后各组比较。结果重复3遍。100 μmol/L FUC预处理MN9D细胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育3 h，1 μg/mL的DCF-DA孵育15 min，倒置荧光显微镜观察细胞内ROS情况，并应用荧光检测仪（480 nm波长）检测ROS的活性，荧光值采用RFU值表达;用100 μmol/L的FUC预处理MN9D细胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，然后移液器洗去培养液，采用Caspase-Glo Assays（a，b）（Caspase-Glo检测试剂盒）。加入Caspase-Glo试剂50 μL，随后加入重组萤光素酶50 μL，然后用Caspase荧光素酶仪器检测细胞内Caspase-3的活性，荧光素酶活性单位用RLU值表达。

1.4 细胞形态学观察

FUC组的FUC预保护孵育1 h后，SEL组在10 μmol/L的SEL预保护1 h，与模型组同时加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，对照组加入相同体积的生理盐水，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，随机取4个视野，100×，观察各组细胞大少形态及视野里细胞数目。

1.5 细胞内相关蛋白表达

用100 μmol/L FUC预处理MN9D细胞1 h，SEL组在10 μmol/L的SEL预保护1 h，与模型组同时加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，后提取各组细胞蛋白，行Western blot检测Bax及Bcl-2蛋白表达，操作方法：向细胞培养板6孔板中加入蛋白裂解液99 μL、cocktail蛋白酶抑制剂1 μL，冰上裂解5 min，用细胞刮收集细胞，移液器把裂解物移到Eppendorf管中，裂解产物超声处理3次。冰浴中静置30 min，12 000 r/min，离心半径6 cm，4℃，离心5 min。将上清移入另一Eppendorf管中，弃去沉，95℃变性5 min，存于-20℃冰箱中待用。灌制10%～12%分离胶和5%积层胶，样品置于凝胶加样缓冲液中，电泳槽中充满电泳缓冲液，加入60 μg样品后连接电源，80 V，20 min，再换成120 V，80～100 min，电泳后取出凝胶进行转膜，将凝胶和硝酸纤维素膜装入标有正、负极的转膜夹板中，置于含有电泳转移缓冲液的转移电泳槽中，100 V，60 min。取出硝酸纤维素滤膜，PBS洗膜10 min，置于含5%脱脂奶粉PBS溶液中封閉，室温轻摇1～2 h。分别加入含5%脱脂奶粉PBST稀释的小鼠抗Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000），并加入用于作为内参的小鼠抗GAPDH抗体（1∶10 000），4℃孵育过夜。次日取出后室温放置30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，加入IRDye800（1∶10 000）标记羊抗小鼠二抗，室温轻摇1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用PBS洗去膜上残留的Tween-20，随后用Odyssey红外成像系统对膜进行扫描，并计算各蛋白条带OD值，实验重复4次，取4次均值，各实验组OD值/对照组OD值进行各组之间的比较。

1.6 统计学方法

采用Prism 5.0软件。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，并继之以Tukey post-hoc检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPP+损伤MN9D细胞存活率的变化及FUC的有效浓度

与对照组（0 μmol/L）比较，50～400 μmol/L MPP+作用12 h以上，MN9D细胞存活率明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。其中100 μmol/L MPP+作用MN9D细胞24 h，MN9D细胞存活率下降50%左右。与模型组比较，FUC 10、100 μmol/L作用24 h明显增加了MPP+损伤的MN9D细胞存活率，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1。

2.2 实验各组MN9D细胞形态的变化

与对照组（图2A）比较，模型组细胞形态变圆，胞体变小，突起变短或消失（图2B）;与模型组比较，FUC组细胞数目增多，细胞形态基本正常，突起基本正常（图2C），SEL组细胞形态明显好转，细胞数目增加（图2D）。

A：对照组;B：模型组;C：FUC组;D：SEL组。FUC：褐藻多糖硫酸酯;SEL：司来吉兰

图2   光学显微镜下各组MN9D细胞形态（100×）

2.3 各组ROS、Caspase-3、Bax/Bcl-2表达

2.3.1 各组细胞内ROS、Caspase-3活性的测定  与对照组比较，模型组ROS荧光明显增加（P < 0.01）;与模型组比较，FUC组、SEL组ROS荧光强度减少（P < 0.01）。与对照组比较，模型组Caspase-3活力明显增加（P < 0.01），FUC组、SEL组细胞内Caspase-3活力较模型组明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

2.3.2 各组细胞内凋亡相关蛋白的Western blot蛋白表达条带及OD值比较  与对照组比较，模型组Bax表达明显增加，Bcl-2表达明显下降（P < 0.01），而FUC组、SEL组Bax蛋白表达较模型组明显下降，Bcl-2蛋白表达较模型组明显增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图4。

3 讨论

PD是第二大神经系统变性病[1]，病程进展较慢，是遗传易感性、年龄老化、环境因素共同作用的结果[5]，主要病理改变为多巴胺能神经元坏死，纹状体内多巴胺含量减少，从而出现锥体外系症状。目前认为氧化应激及细胞凋亡在PD 发病机制中具有重要作用[6-7]，因此寻求具有神经保护作用的治疗药物是当前PD防治的研究热点[8]。

多糖是生物体内重要的生物大分子，是动植物中的支持组织和重要的能量来源[9]。研究[10]发现糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）具有在细胞内溶酶体和线粒体水平上对氧化应激诱导细胞凋亡发生早期负调控的作用。FUC与GAG结构成分非常类似，为了验证FUC对PD神经保护机制，本研究观察了FUC对MPP+诱导的MN9D细胞模型保护作用。结果发现FUC可有效对抗MPP+造成的MN9D细胞死亡，并呈明显的剂量-效应关系。既往研究表明，FUC在体外具有良好的自由基清除能力[11]，本研究结果支持FUC的神经保护作用机制与抗氧化应激有关。MPP+毒性作用均和氧化应激密切相关[12]，MPP+必须经神经元细胞膜上的DAT特异性摄取进入细胞后，通过抑制线粒体复合物Ⅰ和氧化应激发挥毒性作用，并能导致多巴胺能细胞凋亡[13]，根据我们的前期实验[14]，选用100 μmol/L MPP+损伤MN9D细胞作为PD细胞模型。本研究发现100 μmol/L FUC可以拮抗MPP+的神经毒性，使MN9D细胞的活力提高近30%，保护了MPP+损伤的MN9D细胞形态，并能减少MPP+损伤3 h的MN9D细胞内ROS的产生，同时降低了MPP+损伤6 h后细胞内Caspase-3的活性，进而降低了MPP+诱导6 h的MN9D细胞凋亡蛋白Bax的表达，升高了Bcl-2的表达，改善了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达失衡。提示FUC可能通过降低PD细胞模型细胞内ROS的生成，进一步减少ROS导致的Caspase级联反应，进而抑制细胞凋亡，保护MN9D细胞。

研究表明[15-16]，ROS的产生在PD的发生中有重要的作用，并是MPP+损伤级联效应的上游事件。ROS通过促使线粒体释放细胞色素C，进而激活凋亡通路的信号分子Caspase-9和Caspase-3[17]，诱导细胞凋亡[18]，最终导致神经元的死亡。本研究结果发现，FUC可以通过抑制ROS的产生进而抑制Caspase-3的激活。促凋亡蛋白Bax与凋亡抑制蛋白Bcl-2在细胞凋亡中起重要作用[19]，二者的失衡会导致细胞凋亡，而细胞凋亡参与了PD的发生[20]。本研究观察了FUC对MN9D细胞模型Bax及Bcl-2表达的作用，结果发现FUC组及SEL组凋亡相关蛋白Bax表达明显下降，而Bcl-2表达明显增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。线粒体膜电位是线粒体损伤的早期标记，线粒体损伤是导致细胞内ROS升高的主要原因，并互为因果[21]。本研究中发现FUC减少了Caspase级联反应，减少了细胞凋亡相关蛋白Bax表达，增加了Bcl-2的表达，FUC对细胞線粒体的保护作用及可能机制需要进一步深入研究。

本研究在PD细胞模型上提示FUC能通过降低细胞内ROS及细胞内Caspase-3的活力，抑制凋亡，减轻MPP+损伤的MN9D细胞存活率下降及形态改变，进而保护MN9D细胞。说明抗氧化剂抗凋亡可能是FUC保护PD细胞模型的作用机制及靶点，进一步深入研究会成为PD有效神经保护药物的研发基础。

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（收稿日期：2018-06-11  本文编辑：张瑜杰）