量子点/多孔硅光子晶体生物传感器用于检测链霉亲和素∗

王佳佳，李彦宇，贾振红

(1.新疆大学信息科学与工程学院计算机科学与技术博士后流动站，新疆乌鲁木齐830046；2.新疆大学物理科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

0 引言

在过去的十几年中，多孔硅（PSi）作为一种生物兼容性强的传感基底材料被广泛研究[1−4].与光学传感材料一样，作为基于折射率变化的多孔硅传感器对吸附在其表面的分子具有响应速度快、灵敏度高的特点[5−7].多孔硅基底光学传感器通过荧光光谱分析技术能够实现化学以及生物检测[8,9].此外，与基于折射率变化的检测方法（检测浓度为µM）相比，基于荧光变化的检测方法（检测浓度为nM）具有更高的灵敏度.因此，基于荧光变化的检测系统能够检测到更微弱的信号，从而实现高灵敏的生物检测.

自从发现多孔硅的室温光致发光以来，多孔硅的发光特性引起了物理学家的广泛关注.起初，单层多孔硅作为传感基底，主要通过Er掺杂能够实现在红外波段的光致发光[10]；通过离子辐照引起的缺陷来实现发光猝灭[11]；通过多孔硅的荧光猝灭法确定抗体溶液的pH值对固定化过程的影响[12].后来，单层多孔硅基底被用来检测生物分子，降低了染料分子标记的MS2病毒的检测限[13]，并通过荧光恢复实现生物检测[14].随着人们对多孔硅研究的逐渐深入，微腔器件的腔层具有提高单位体积内光子能量的作用，因此多孔硅微腔作为传感器基底用来收窄荧光物质的出射荧光[15,16].近年来，人们考虑利用多孔硅光子晶体具有高反射带的特性，减少出射荧光在基底中的损失，从而实现对荧光物的出射荧光的增强[17,18].

量子点（QDs）由于荧光量子产率高、折射率大的特点广泛应用于发光器件、生物传感器中[19−21].单层多孔硅与CdTe/CdS量子点的混合结构界面氧化能够影响发光性能[22].量子点/多孔硅混合金属半导体光电探测器能够提高光响应度[23].用CdTe/CdS量子点沉积在SiO2纳米柱阵列上能够实现光致发光的增强，这种增强主要是由于粗糙表面对量子点吸附量的增加和二维光子晶体带隙结构光波调制表面场的增强[24].因此，光子晶体与量子点的新型混合结构可以用作高灵敏度的光学生物传感器的制备.

生物素和链霉亲和素的反应具有很高的特异性，是许多临床试验中实现生物检测的重要手段[25].生物亲和性共轭已被广泛用于连接供体和受体，以研究共振能量转移对距离的依赖性[26].此外，利用生物素和链霉亲和素相互识别作用，也可以实现基于局域表面等离子体共振位移变化的生物传感器[27].蛋白质、脂类、DNA和其他生物大分子通过生物素和链霉亲和素间的相互作用与传感器基底实现共价连接[28,29].尽管生物素和链霉亲和素的结合已经在文献中报道过，但在量子点的荧光检测中的应用还很少.更重要的是，正如我们之前报道的，量子点/多孔硅光子晶体的嫁接结构是通过生物素-链霉亲和素特异性结合技术实现的[30].随后，我们制备并更具体的描述这种嫁接结构的生物传感器检测系统，并且实现了定量检测.

本文中，水溶性CdSe/ZnS量子点标记的生物素与链霉素修饰的多孔硅光子晶体相连接.当链霉亲和素和生物素发生反应时，量子点与多孔硅孔间接相连.光子晶体的高反射带增强了量子点的出射荧光信号，使得传感器实现了高灵敏度的生物检测.

1 材料和方法

1.1 多孔硅的制备

实验选择的是高掺杂p型<100>单晶硅片(电阻率0.03∼0.06 Ω·cm).腐蚀之前，分别用乙醇、去离子水和超声波清洗硅片10min，用40%氢氟酸和无水乙醇按1:1（v/v）的比例混合的电解质溶液对硅片进行电化学阳极腐蚀.实验中光子晶体设置为26层.第一层是生物分子的吸附层，第二层是隔离层，其余的24层是一个12个周期的低折射率和高折射率交替周期变化的分布式布拉格反射镜层.表1给出了制备多孔硅样品的电流密度以及多孔硅薄膜的有效折射率和厚度值.在功能化之前，用去离子水（DI）清洗基底并在氮气环境中干燥.多孔硅样品的模拟反射光谱如图1所示，中心带隙波长位于533nm.

表1 多孔硅光子晶体的主要参数Tab 1 Parameters of Selected PSi Samples

1.2 多孔硅样品的功能化

多孔硅传感器的制备步骤主要有氧化、硅烷化、戊二醛、链霉亲和素连接等步骤.为了提高多孔硅器件的稳定性，新制备的多孔硅样品室温下在H2O2（30%）溶液中氧化24h.氧化后的多孔硅样品在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES 4%）溶液（APTES:DI:甲醇=10:10:1，v/v）中浸泡1h，然后用乙醇和DI彻底冲洗，氮气环境中干燥，在真空干燥箱（100℃）中充分干燥10min后，用戊二醛溶液（2.5%）对硅烷化后的多孔硅样品醛基化1h，以形成偶联基团.用磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH:7.4）和去离子水反复清洗多孔硅样品3次，每次5min，去除多余的戊二醛分子，自然干燥保存.

图1 MATLAB模拟的多孔硅光子晶体的反射光谱Fig 1 The simulation reflectance spectrum of PSi sample using MATLAB

1.3 链霉亲和素与功能化多孔硅连接

用移液器取50µL不同浓度的链霉亲和素（0.1nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM）分别滴在功能化的多孔硅样品上，在37℃培养箱中放置2h后，用PBS（pH=7.4）反震荡清洗样品三次，每次5min，除去未连接的链霉亲和素分子，并在氮气环境中干燥.然后用3M乙醇胺缓冲液（EA，ph=9.0）封闭抑制非特异性的反应，并且用PBS震荡清洗样品5min后，自然干燥保存.

1.4 生物素的检测

实验中使用的探针分子是水溶性羧基QDs（CdSe/ZnS）标记的生物素(QDs-生物素).QD-生物素的大小约为7nm，荧光峰位于535nm.图2为QD- 生物素的吸收光谱和荧光光谱，最强吸收峰位于510nm处.用移液管取50µL 的QD-生物素滴加到连接有链霉亲和素的多孔硅样品上，在37℃恒温箱中放置2h，待链霉亲和素和生物素充分反应，用PBS冲洗5min，除去未反应的QD-生物素，并且自然干燥.荧光光谱测量使用的是紫外可见荧光分光光度计（Hitachi F-4600，日本），狭缝宽度为5nm，激发功率400mW，从样品中采集5个不同点的数据并取平均.反射光谱的收集使用的是紫外-可见分光光度计（Hitachi U-4100，日本）.多功能场发射扫描式电子显微镜FESEM（蔡司Supra55 VP，德国）用来测量多孔硅样品的表面和截面形貌.

图2 QD标记的生物素的紫外吸收光谱和荧光光谱Fig 2 Absorption spectrum and fluorescence spectrum of OD-biotin

2 结果与讨论

本实验选择的光子晶体器件分为三部分，光子晶体器件的截面如图3（a）所示.第一部分是高电流密度制备的生物分子识别层，孔径约30nm，如图3（b）所示.这保证了即使多孔硅的孔径由于功能化过程中分子的吸附而减小，孔径也能满足7nm的QD-生物素分子进入到多孔硅孔洞内的要求.为了保证生物分子只能进入生物识别层，因此光子晶体的第二层设计为孔径为10nm的隔离层，如图3（c）所示.第三部分是具有低折射率和高折射率周期变化的布拉格反射镜，高反射禁带的中心波长为533nm.按照上述条件设置多孔硅光子晶体的目的是为了实现QD-生物素只分布在生物分子的识别层，避免进入布拉格反射镜层，便于研究布拉格反射镜对量子点荧光的增强.

图3 多孔硅光子晶体的扫描电镜图Fig 3 SEM images of the PSi photonic crystal.

图4 QD-生物素（0.1nM）在功能化多孔硅单层器件和光子晶体基底上的荧光光谱Fig 4 Fluorescence spectra of QD-biotin ( 0.1 nM)infiltrated inside the functionalized PSi single layer device and photonic crystal

通过氧化、硅烷化、戊二醛和链霉亲和素连接等步骤实现了多孔硅传感器的制备.反射光谱随着每一步功能化的移动帮助我们确认传感器的成功制备[30].量子点-生物素进入到多孔硅光子晶体中使得荧光信号增强的现象对这种纳米混合结构在生物传感上的应用具有重要指导意义.为了更直观的观察多孔硅光子晶体在生物传感应用的优越性，我们期望在多孔硅光子晶体器件上检测的QD-生物素表现出不同于单层多孔硅衬底上检测的QD-生物素的荧光发射特性.本实验中作为对比器件的单层多孔硅采用的是低折射率（110mA/cm2）的多孔硅薄膜.QD-生物素探针与靶链霉亲和素分子发生亲和反应，实现了完整的生物检测.多孔硅固体基质上的QD-生物素的荧光曲线（荧光峰530 nm），与溶液（荧光峰535 nm）相比，QD-生物素的荧光光谱曲线发生了偏移，图4显示了这一趋势变化.光谱位移的变化主要是因为生物素和链霉亲和素的特异性反应，导致发光中心的移动.本研究中在同等条件下制备两种类型的多孔硅器件进行QD-生物素检测，即多孔硅光子晶体和单层多孔硅基底.从这两种结构器件基底上检测到的QD-生物素的出射荧光的峰位的移动，表明QD-生物素和链霉亲和素发生特异性反应.与单层多孔硅相比，多孔硅光子晶体上检测到的QD-生物素的荧光增强与光子晶体的光波调制有关.量子点共轭物（QD-生物素与链霉亲和素耦合反应的共轭）的荧光发射峰位于530nm，恰好位于多孔硅光子晶体的带隙范围内.带隙的高反射率带有效地阻止了光波在该波段的继续传播，使得检测到更多的出射荧光，从而提高了量子点共轭物的荧光强度.多孔硅的大比表面积提高了探针分子的吸附能力，隔离层可以有效地阻止生物分子进入布拉格反射镜.探针分子集中在第一层，可以增强QD-生物素的荧光强度，高反射带隙可以进一步实现出射荧光增强.从实验中可以得出，在多孔硅光子晶体器件基底上，量子点共轭物的荧光强度是单层多孔硅基底上检测的荧光强度的2倍（图4中曲线的强度比）.

多孔硅光子晶体生物传感器通过检测不同浓度（0.1nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM）的链霉亲和素功能化的多孔硅光子晶体和固定浓度的QD-生物素（2.5nM）的特异性反应，实现浓度与荧光信号强度相关性检测.从图5中可以观察到，随着链霉亲和素浓度的增加，荧光强度逐渐增强.在QD/多孔硅光子晶体复合材料中，由于多孔硅具有大比表面积，可以降低因荧光团聚集而引起的猝灭.因此，这种纳米混合系统对低浓度的生物检测具有较强吸引力.

图5 量子点-共轭物的荧光随链霉亲和素浓度变化Fig 5 The fluorescence intensity of QD-conjugate in PSi increased with the increased of streptavidin concentration

图6 量子点-共轭物荧光强度与链霉亲和素浓度的线性关系图Fig 6 Relationship between the fluorescence intensity of QD-conjugate and streptavidin concentration

图6记录了在不同浓度的链霉亲和素作用下，量子点-生物素在多孔硅光子晶体基底上的荧光强度变化.线性方程为y=405.3+403.5x，拟合系数为0.995，其中y代表QD共轭物的相对荧光强度，x代表链霉亲和素浓度.多孔硅光子晶体生物传感器的检测限为17.3µM.LOD=3σ/s，其中σ是空白测量的标准偏差，s是线性方程的斜率.与基于多孔硅光子晶体的反射式生物传感器（检测限为nM）相比[31−33]，基于荧光检测技术手段的多孔硅光子晶体生物传感器的LOD降低了3个数量级.

3 结论

光子晶体结构是制作高灵敏度生物传感器的一种可行方法.利用荧光检测技术手段，通过QD-生物素与固定在多孔硅基底上的链霉亲和素的特异性反应实现生物检测.相对于单层多孔硅，多孔硅光子晶体的高反射率带隙使得检测的量子点荧光强度增强了一倍，提高了光学生物传感器的灵敏度，检测限为pM.结果表明，基于光子晶体的生物检测传感器具有良好的特异性和高灵敏度，将进一步应用在生物检测上.