纳米铁联合氧化石墨烯对垃圾堆肥基质高羊茅生理生态的影响

路国华,赵树兰,多立安

天津师范大学生命科学学院,天津市动植物抗性重点实验室,天津 300387

随着我国人口数量和人民生活水平的提高,城市生活垃圾的产生量与日俱增。截止到2015年底,生活垃圾产生量已从1980年的每天0.5 kg/人增加到2015年的1.2 kg/人,较过去30年增长了一倍,如何处理快速增长的生活垃圾已成为亟待解决的环境问题之一[1]。生活垃圾堆肥化利用是实现垃圾减量化和资源化的有效方式。垃圾堆肥含有大量的有机质和植物生长所需的营养物质,可以提高土壤肥力,改善土壤理化性质,促进植物生长,提高作物产量[2]。然而,由于我国未实行垃圾分类,垃圾堆肥中重金属含量较高,长期施用会导致土壤重金属含量升高,并通过植物吸收进入食物链,危害人类健康,从而限制了垃圾堆肥的应用[3]。

另一方面,随着我国城市的快速发展,人们对园林绿化和生态环境的要求不断提高,草坪作为园林绿化的一部分发挥着极其重要的作用。目前,城市草坪建植的多种方式之中,规模化生产地毯式草皮被普遍采用。但地毯式草皮生产一般选择农田的优质耕层土壤作为基质,几次生产过后,优质耕层土壤随草皮被带走,因而这种草皮生产方式存在着消耗土壤资源、破坏农田生态环境及草皮杂草难控制等弊端[4]。近年来,国内外利用工农业废弃物为土壤替代基质进行无土草皮生产展开了一系列的研究,以探讨不同土壤替代基质对草皮性状的影响[5-7]。赵树兰等[8]以生活垃圾堆肥代替土壤作为草皮培养基质,与园土基质草皮的相关生长参数进行了比较研究,表明以生活垃圾堆肥为基质的无土草皮性能符合草皮培植技术性能要求。虽然生活垃圾堆肥可作为基质用于草皮生产,但基质中的重金属问题未得到根本解决,仍存在污染地下水、影响植物生长的风险。因此,若能解决草坪堆肥基质中重金属问题,堆肥基质草坪建植体系的应用方式将会更加安全有效。

钝化法是一种从生物可利用态向稳定态重金属转移的技术方法,被广泛应用于重金属污染土壤的修复[9-10]。零价纳米铁(nZVI)具有粒径小、比表面积大兼具吸附性与还原性强等特点,其在水中具有较强去除重金属能力,被认为是处理污染土壤与地下水的有效选择[11-13]。氧化石墨烯(GO)具有相对较大的比表面积,其表面存在丰富的含氧官能团,可以快速高效去除水中重金属离子,由于其独特的物理化学特性,是一种极好的吸附剂[14]。两种材料对重金属的吸附能力较强,具有钝化修复堆肥重金属的潜力。但是,向堆肥基质中添加外源物质同样可能会影响植物的正常生长,而其对草坪植物生长的影响尚未见文献报道。

因此,本研究选择生活垃圾堆肥作为高羊茅培养基质,通过室内盆栽试验,研究草坪基质中添加GO和不同比例nZVI对高羊茅生长和生理特性的影响,为nZVI联合GO安全有效地应用于堆肥基质重金属的钝化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾堆肥处理厂。试验前对堆肥进行预处理,去除其中的塑料薄膜、砖瓦、石块和玻璃等杂物,风干后,过2 mm筛。堆肥理化性质为：pH 7.62,有机质含量221.25 g/kg,全氮13.48 g/kg,有效磷0.078 g/kg,C/N为8.37,饱和含水量0.76 mL/g；重金属(Cd、Cr、Cu、Pb、Zn)含量分别是1.97、67.00、239、172、496 mg/kg。高羊茅(Festucaarundinacea)种子购买于天津曹庄花卉市场。

供试多层氧化石墨烯(GO)购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司,厚度为3.4—8 nm,片层直径为10—50 μm,层数为5—10层,比表面积为100—300 m2/g。纳米铁购自于清河县科工冶金材料有限公司,粒径为50 nm。

1.2 试验设计

取堆肥100 g,按一定比例加入钝化材料混匀后,分别放入直径6.3 cm、高6.8 cm的塑料盆中,作为高羊茅培养基质。试验处理如下：①添加1% nZVI(N1)；②添加3% nZVI(N3)；③添加5% nZVI(N5)；④添加1% GO(G)；⑤添加1% GO+1% nZVI(GN1)；⑥添加1% GO+3% nZVI(GN3)；⑦添加1% GO+5% nZVI(GN5),以不添加钝化剂的纯堆肥为对照(CK),每个处理4次重复。将300粒大小均一、籽粒饱满的高羊茅种子均匀播撒于基质上。培养期间定期浇水,使含水量保持在最大田间持水量的60%。植物培养期间的环境温度为13—25℃,相对湿度为15%—31%,光照为透入室内的自然光。

1.3 指标测定

1.3.1种子萌发相关指标测定

种子从第4天开始萌发,每天记录萌发的种子数。萌发10 d时,测定发芽率、发芽势和发芽指数。发芽率Gr(%)=(发芽种子数/供试种子数)×100；发芽势(%)=(萌发起4 d内发芽种子数/供试种子数)×100；发芽指数GI=∑(Gt/Dt),式中Gt为在t日的发芽种子数,Dt为相应的发芽天数。

1.3.2地上生物量测定

在播种第50 d时收获植物地上部分,在108℃下杀青20 min,80℃条件下烘干至恒重后称量。

1.3.3叶绿素含量的测定

称取新鲜叶片0.5 g,剪成1—2 mm碎片,浸泡于20 mL丙酮∶乙醇(1∶1)溶液中24 h,浸泡液为待测液。取上述浸泡液1 mL,加丙酮4 mL稀释后转入比色杯中,以丙酮为对照,用紫外可见分光光度计分别测定663、645 nm处的OD值,计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。

1.3.4保护酶活性与丙二醛含量的测定

保护酶活性的测定：取新鲜草样0.5 g,加入预冷的研钵中,加入pH 7.8的磷酸缓冲液5 mL,少量石英砂,在冰浴下研磨成浆；再加入5 mL磷酸缓冲液研磨,定容到15 mL的离心管中。在4℃,8000 r/min下离心30 min,上清液用于保护酶活性的测定。POD活性的测定采用愈创木酚法[15],CAT活性测定采用紫外分光光度法[16],POD和CAT的活性单位(U)定义为：每克鲜质量每分钟分别使OD470和OD240增加0.1的酶量为一个酶活性单位。SOD活性测定采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法[17],以每克鲜质量抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位。

丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸氧化法。取叶片0.5 g,剪碎,加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨,再加入8 mL TCA充分研磨,匀浆以4000×g离心10 min。取2 mL上清液,加入2 mL 0.6%TBA液,混匀,在试管上加盖塞,置于沸水浴中煮沸15 min,迅速冷却后离心,对照以4 mL去离子水代替提取液。取上清液,用紫外分光光度计(SHIMADZU UV- 1700)测定532和450 nm处的OD值。计算MDA浓度,折算成每克鲜重质量组织MDA含量。

1.3.5重金属含量的测定

准确称取高羊茅地上部干重0.1 g,加入硝酸和双氧水(5∶1),在120—140℃下消解,过滤后用1% HNO3溶液定容至25 mL,用原子吸收光谱仪测定植物体内重金属(Cu、Cd、Pb、Zn、Cr)含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行单因素方差分析,并采用Turkey法,在P=0.05水平进行数据差异显著性检验,采用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 钝化剂对高羊茅种子萌发的影响

播种4 d后,高羊茅种子开始萌发,10 d时达到萌发稳定。如表1所示,单独添加nZVI对高羊茅种子萌发无显著影响。添加GO后,发芽率、发芽势和发芽指数均显著提高,且随着nZVI添加比例的增加而增加。发芽率与发芽指数均在GO+5% nZVI处理中达到最高,较对照分别提高了109%和108%。发芽势在1% GO处理中达到最大,较对照提高了92%。

表1 钝化剂对高羊茅种子萌发的影响

CK：对照,control；N1：1%纳米铁,1% nanoscale iron；N3：3%纳米铁,3% nanoscale iron；N5：5%纳米铁,5% nanoscale iron；G：1%氧化石墨烯,1% graphene oxide；GN1：1%氧化石墨烯+1%纳米铁,1% graphene oxide+1% nanoscale iron；GN3：1%氧化石墨烯+3%纳米铁,1% graphene oxide+3% nanoscale iron；GN5：1%氧化石墨烯和5%纳米铁,1% graphene oxide+5% nanoscale iron；不同字母表示差异显著(P<0.05,n=4)

2.2 钝化剂对高羊茅地上干重及叶绿素含量的影响

添加钝化剂对高羊茅地上干重和叶绿素含量的影响如表2所示。除1% nZVI对高羊茅地上干重无显著影响外,单独添加3%、5% nZVI及联合GO处理均显著促进了地上生物量的积累,在GO+5% nZVI处理下达到最大,较对照增加25%。

各钝化剂处理叶绿素a与总叶绿素含量均显著高于对照,且随nZVI添加比例的升高呈现增加的趋势,总叶绿素含量在GO+5% nZVI处理达到最大,比对照提高了31%。与叶绿素a和总叶绿素含量不同的是,钝化剂的添加显著降低了叶绿素b含量。

表2 钝化剂处理对高羊茅地上干重及叶绿素含量的影响

2.3 钝化剂对高羊茅保护酶活性和丙二醛含量的影响

钝化剂对高羊茅保护酶活性和丙二醛含量的影响如图1所示。单独添加nZVI 处理POD活性随添加比例的增加而升高,3%和5% nZVI处理分别显著高出对照42%和55%；共同添加GO和3%、5% nZVI处理,POD活性显著高于对照；相同比例nZVI处理,有GO处理要低于无GO处理,但差异不显著。单独添加3%、5% nZVI以及GO+5% nZVI处理,SOD活性显著升高,在5% nZVI处理组达到最大,较对照提高14%；共同添加GO和1%、3% nZVI处理,SOD活性分别低于单独添加1%、3% nZVI处理,差异显著。添加钝化剂处理CAT活性显著降低,并随nZVI添加比例的增加而下降,GO+5% nZVI处理最低,较对照降低了59%。单独添加GO的处理,CAT活性较对照降低了52%；共同添加GO和nZVI较单独添加nZVI 处理,CAT活性显著降低,在GO+5% nZVI处理降低最多,达到了42%。

与对照相比,添加钝化剂处理MDA含量显著降低,GO+3% nZVI处理为最低,降低了48%；单独添加GO处理比对照减少29%；共同添加GO和3%、5% nZVI处理较单独添加3%、5% nZVI处理,MDA含量显著降低。

图1 钝化剂对高羊茅保护酶活性和MDA含量的影响Fig.1 Effects of passivators on protective enzyme activity and MDA content ofFestuca arundinaceaCK：对照,control；N1：1%纳米铁,1% nanoscale iron；N3：3%纳米铁,3% nanoscale iron；N5：5%纳米铁,5% nanoscale iron；G：1%氧化石墨烯,1% graphene oxide；GN1：1%氧化石墨烯+1%纳米铁,1% graphene oxide+1% nanoscale iron；GN3：1%氧化石墨烯+3%纳米铁,1% graphene oxide+3% nanoscale iron；GN5：1%氧化石墨烯和5%纳米铁,1% graphene oxide+5% nanoscale iron；图柱上不同字母表示差异显著(P<0.05,n=4)

2.4 钝化剂对高羊茅地上部重金属含量的影响

如表3所示,除单独添加1% nZVI处理外,钝化剂均显著降低了高羊茅地上部Cu和Pb含量,且添加GO后降低的更多。对于Cd、Zn而言,共同添加GO和nZVI处理,其含量均显著低于对照；单独添加nZVI处理和对照差异不显著。除单独添加1%和3% nZVI处理外,其他钝化剂处理,Cr含量均显著低于对照。与单独添加nZVI相比,共同添加GO与nZVI,显著降低Cu、Cd、Pb、Cr含量。

3 讨论与结论

种子萌发是植物生长的初始阶段,它可以对外界生长环境做出敏感反应,因此种子萌发试验被广泛用于评价堆肥质量研究中[18]。研究发现,堆肥中添加GO能显著促进高羊茅种子的萌发。Khodakovskaya等[19]研究发现,碳纳米材料处理能显著促进番茄种子萌发,认为碳纳米材料能够穿透厚的种皮,促进种子对水分的吸收,从而促进番茄种子的萌发和幼苗的生长。吴金海等[20]研究发现,5 mg/L GO处理能显著提高油菜种子的发芽势。这些研究表明,一定浓度的氧化石墨烯,会对种子萌发起促进作用,与本文研究结果一致。

表3 钝化剂处理对高羊茅地上部重金属含量的影响

叶绿素是与植物光合作用最密切相关的一种色素,其含量的高低可以衡量植物光合能力的强弱。试验结果表明,单独添加nZVI与共同添加GO和3%、5% nZVI能显著增加高羊茅叶绿素含量,促进其光合作用,这与对植物地上生长影响相一致。王静等[21]研究发现,增加供铁可显著提高油松幼苗的光合能力；龙文靖等[22]研究发现,玉米苗期叶绿素含量随供铁浓度增加而增加。由于nZVI具有强的还原性,它能被氧化释放出二价和三价的铁离子[13],从而提高了堆肥中可供植物吸收的铁元素含量,进而导致光合作用增强。而由nZVI氧化产生的铁离子是否会引起毒性效应,还有待于进一步研究；但也有报道,10%的nZVI经过老化后,并未对土壤及其微生物产生不良影响[23]。另外,纳米材料本身也能通过抑制氧化胁迫来提高逆境条件下植物的光合能力[24]。研究发现,3%、5% nZVI处理及联合GO,生物量显著增加。有研究显示,碳纳米材料能促进根的伸长和植物生物量的积累[25],这与本研究的结果一致。植物体内的重金属含量也表明,添加GO和nZVI能降低植物对堆肥重金属的吸收,说明GO和nZVI能对堆肥重金属起到吸附钝化作用,从而减轻了重金属对植物的胁迫,促进了生物量的积累。

正常生长条件下,植物细胞产生的活性氧与本身的抗氧化防御系统处于动态平衡状态。植物在胁迫环境下,体内活性氧增加,过量的活性氧会导致生物大分子的氧化,植物抗氧化防御系统通过提高抗氧化酶活性来减小活性氧的伤害。通过MDA含量来反映脂质过氧化水平,保护酶活性可以用来判断植物受胁迫程度,SOD可以催化超氧自由基生成H2O2,而H2O2可以被POD和CAT所清除[26]。本研究结果表明,添加3%、5% nZVI的处理,POD和SOD的活性升高, MDA含量均下降,说明nZVI处理提高了抗氧化酶活性,清除活性氧的能力增强,从而减轻了膜质过氧化。Li和Huang[27]的研究发现,纳米羟基磷灰石(nHAP)能诱导Cd胁迫下小白菜抗氧化酶活性,抑制了植物对Cd的吸收,降低MDA含量,说明nHAP降低了污染土壤中Cd的生物有效性,增强了植物的抗Cd能力。本研究中,钝化剂处理CAT活性降低,可能是在清除H2O2过程中导致的酶失活或酶合成受阻[28]。因此,在3%、5%nZVI处理中,高羊茅POD和SOD活性升高,MDA含量下降,可能是因为GO和nZVI钝化了堆肥中重金属,减少了植物对重金属的吸收,减轻了植物所受胁迫的伤害。

综上所述,堆肥基质中施入GO和nZVI,促进了高羊茅种子的萌发,且随nZVI添加比例的增加而提高。3%、5% nZVI单独添加以及和GO的共同添加,均提高了高羊茅叶绿素含量和地上生物量。3%、5%的nZVI提高了高羊茅SOD和POD活性,降低了MDA含量,减少了植物对堆肥重金属的吸收。因此,nZVI和GO两种材料能够固定堆肥中的重金属,减少植物对重金属的吸收,对植物生长具有一定的促进作用。