不同比例LA/ALA对HepG2细胞炎症因子的影响

刘睿杰，塔 薇，王莉梅，常 明，金青哲，王兴国

(1.江南大学 食品学院，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122；2.无锡易麦园食品有限公司，江苏 无锡 214000)

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是人体必需的重要营养物质，包括n-6和n-3 PUFAs，具有抗氧化、抗炎等生理作用，在人体健康中起重要作用。膳食中n-6与n-3 PUFAs 的摄入比例一直备受关注，但目前各国膳食脂肪酸构成比的推荐值不尽相同，诸多体内和体外实验结果中n-6与n-3 PUFAs最佳比例尚无定论。

PUFAs可以调节炎症反应过程的炎症因子表达[1]，是类花生酸前物质，可代谢生成抗炎性类花生酸物质，在炎症反应中发挥重要作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)是炎症反应过程中最重要、最具代表性的细胞因子，前者对后者有很强的促进作用。IL-6是一种自分泌或旁分泌的多效性细胞因子，在许多细胞中都有明显的表达，当炎症发生时，IL-6的量迅速增加，影响炎症反应过程[2-4]。有报道称可通过检测TNF-α和IL-6水平高低来反映炎症的严重程度[5]。白介素-10(IL-10)是一种多肽，由多种不同类型的细胞产生，在调节过度的免疫应答和炎症反应的最终结局方面发挥多效性作用，可以抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生[6]。PUFAs代谢产生的抗炎性物质如脂氧素(LXs)、保护素等可调控炎症反应，由PUFAs衍生而来的抗炎性脂氧素是最有效的炎症调节剂[7-8]。

n-3 PUFAs有抗炎作用，可有效抑制TNF-α、IL-6以及IL-1等细胞炎性因子的产生[9-11]。Weldon等[12]研究发现，EPA和DHA可抑制人静脉内皮细胞产生IL-6。Zhang等[13]研究发现，n-3 PUFAs通过减少炎性细胞因子TNF-α、IL-6、环氧合酶-2(COX-2)以及IL-1的分泌来抑制大鼠术后的炎症反应。EPA可有效降低经前列腺素刺激的人肝细胞产生TNF-α和IL-6[14]。AA可代谢生成前列腺素E2和白三烯，这两种物质在炎症反应中起很大作用[15]。目前关注n-3与n-6 PUFAs 比例的研究多集中于EPA和DHA，对植物油中典型的n-3与n-6 PUFAs比例的关注较少。

本研究通过体外培养HepG2细胞，选取植物油中典型n-3和n-6多不饱和脂肪酸(α-亚麻酸(ALA)和亚油酸(LA))为代表，以促炎因子TNF-α、IL-6以及抗炎因子IL-10和抗炎介质LXA4为目标因子，研究不同比例LA/ALA对HepG2细胞炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

α-亚麻酸(ALA，纯度≥99%)、亚油酸(LA，纯度≥99%)及四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、DMEM培养基，美国Gibco公司；胰酶及双抗，吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，上海生工生物有限公司；乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾等(分析纯)，国药化学试剂有限公司；脂多糖(LPS)，美国Sigma公司；TNF-α、IL-6及IL-10酶联免疫试剂盒，南京建成生物工程研究所；LXA4酶联免疫试剂盒，上海丰寿实业有限公司；人HepG2(ATCC HB-8065)细胞株，无锡莱弗思生物实验器材有限公司。

1.1.2 仪器与设备

TS100-F倒置相差显微镜，日本Nikon公司；二氧化碳培养箱、HFU 586 Basic超低温冰箱，美国Thermo公司；M5酶标仪，美国Molecular Devices公司；SCIENTZ JY 92-IIN超声波细胞粉碎机；Alpha-l 500紫外可见分光光度计；血球计数器。

1.2 实验方法

1.2.1 HepG2细胞培养

HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清以及1%双抗的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2和95%相对湿度的二氧化碳培养箱中，隔天换液，5 d传代。本实验所用细胞均为10～30代HepG2细胞。

1.2.2 不同比例LA/ALA对HepG2细胞影响

取对数生长期HepG2细胞，以105个/mL密度接种于6孔板中，在细胞培养液中先加入0.1 μg/mL LPS刺激24 h后，用磷酸缓冲液(PBS)洗两次，再分别加入终浓度为60 μmol/L各实验组溶液(见表1)，设立与实验组含相同浓度BSA的空白对照组。各组样品处理24 h后收集细胞培养液，离心除去死细胞，取上清液待分析。

表1 各实验组脂肪酸组成

1.2.3 酶联免疫法测定细胞TNF-α、IL-6、IL-10和细胞脂氧素水平

取1.2.2待分析液，用酶联免疫试剂盒测定细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和LXA4水平。以各处理条件下炎性因子表达量、脂氧素水平相对于空白对照组的含量表示PUFAs处理后的变化。

1.2.4 数据统计分析

2 结果与讨论

2.1 不同比例LA/ALA对HepG2细胞TNF-α和IL-6的影响

LPS诱导HepG2细胞24 h后，刺激细胞产生炎症因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2细胞24 h后，各实验组对HepG2细胞TNF-α和IL-6水平的影响结果见图1。

TNF-α和IL-6均是细胞内促炎因子，其水平高低可反映细胞炎症的严重程度。由图1可知，各实验组细胞TNF-α和IL-6的表达量与空白对照组相比显著下降(P<0.05)；与组4相比，其余各组TNF-α和IL-6表达量均显著上升(P<0.05)。各实验组对HepG2细胞TNF-α和IL-6表达量抑制程度的顺序为组4>组3>组2≈组1，组4>组5>组6≈组7。说明不同比例LA/ALA均能降低HepG2细胞的TNF-α和IL-6表达量，其中组4作用效果最明显。

注：*P<0.05，与空白对照组对比的显著性；#P<0.05，与组4对比的显著性。下同。

图1 不同比例LA/ALA对HepG2细胞TNF-α和IL-6含量的影响

2.2 不同比例LA/ALA对HepG2细胞IL-10的影响

LPS诱导HepG2细胞24 h后，刺激细胞产生炎症因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2细胞24 h后，各实验组对HepG2细胞分泌IL-10水平的影响结果见图2。

图2 不同比例LA/ALA对HepG2细胞IL-10含量的影响

IL-10是细胞内的抗炎因子，可以抑制促炎性细胞因子的产生，起到免疫调节作用，在维持机体免疫平衡方面发挥重要作用。由图2可知，与空白对照组相比，各实验组HepG2细胞产生的IL-10的含量显著上升(P<0.05)；与组4相比，其余各组IL-10含量均显著下降(P<0.05)。各实验组对HepG2细胞IL-10表达量增加程度的顺序为组4>组3>组2≈组1，组4>组5>组6≈组7。说明不同比例LA/ALA均能升高HepG2细胞的IL-10表达量，其中组4作用效果最显著。

2.3 不同比例LA/ALA对HepG2细胞脂氧素水平的影响

LPS诱导HepG2细胞24 h后，刺激细胞产生炎症因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2细胞24 h后，各实验组对HepG2细胞分泌LXA4水平的影响结果见图3。

图3 不同比例LA/ALA对HepG2细胞LXA4含量的影响

PUFAs能经酶促氧化产生具有抗炎活性的LXA4。由图3可知，与空白对照组相比，各实验组均显著性促进HepG2细胞LXA4合成(P<0.05)。其余各实验组与组4相比，LXA4水平明显均有降低(P<0.05)，作用效果存在差异。作用顺序为组4>组3>组2≈组1，组4>组5>组6≈组7，组4对细胞LXA4水平的增加作用最显著。

3 结 论

60 μmol/L不同比例LA/ALA作用经LPS诱导的HepG2细胞24 h后，各实验组均显著抑制HepG2细胞的促炎因子TNF-α和IL-6的产生，增加抗炎因子IL-10的产生。说明不同比例LA/ALA增加了IL-10的表达量，使抗炎因子IL-10发挥其多效性，使得促炎因子TNF-α和IL-6表达量下降，从而发挥调节炎症，降低炎症反应程度。同时，不同比例LA/ALA还通过增加抗炎脂类介质LXA4含量，影响HepG2细胞的炎症反应，其中LA与ALA最佳配比为1∶1。