岗梅花粉活力 柱头可授性及种子发芽率研究△

兰金旭，谈英，刘晖晖*，邢建永，吴正军，李子璇

1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046；2.华润三九医药股份有限公司 研发中心，广东 深圳 518110；3西藏大学 医学院，西藏 拉萨 850000

岗梅为冬青科冬青属植物梅叶冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.的干燥根、茎，是我国清热解毒类中成药的原料药，主要用于感冒灵、众生丸等，在华南地区作为南方凉茶的主要成分广泛使用[1]。野生岗梅的自然生长速度较慢，近年来岗梅药材应用量增加导致野生资源蕴藏量急剧下降，目前需要通过人工种植增加岗梅资源量来逐步满足市场需求。岗梅主要以种子繁育，在育苗过程中发现不同批次种子发芽率存在较大差异。植物开花传粉是形成种子的关键步骤，花的结构、开放时间、花粉和柱头活力、繁育系统等决定着传粉和授粉等有性生殖过程[2-4]，影响种子发育程度和发芽率。目前，岗梅研究在化学成分和药理方面较多[5]，关于岗梅花的传粉特性、种子发芽率方面较少[6-7]。本实验对岗梅的花粉活力、柱头可授性和开花习性进行研究，并检测不同批次岗梅种子的千粒质量和发芽率，了解岗梅的生殖生物学特性，为岗梅种子质量提高、育种和人工栽培提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

岗梅花期、访问昆虫调查完成于广东省平远县仁居镇青草湖岗梅规范化种植基地，基地面积30 hm2；花粉活力、柱头活性检测材料来自于广州中医药大学药王山。传粉套袋观察完成于药王山的两个种植种群，其中一个群落都为雌株，与另一个群落分别位于不同的区域，且周边10 m内无雄株存在。岗梅种子采收于广东省平远县仁居镇青草湖岗梅规范化种植基地，2016年6月15日至6月30日采收4批。岗梅植株经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为梅叶冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.

1.2 方法

1.2.1 花期调查 以单块地集中种植的岗梅种群为调查单位，该种群开花数量超过总花蕾数10%记为始花期，60%为盛花期；70%花脱落为结束期。计算雌雄株的开花持续时间。

1.2.2 花粉数量、活力及柱头活性检测 花粉数量统计采用显微观察法。随机选取10朵花，分别将每朵花的全部花药取出，放入离心管中破碎并定容至1 mL，摇匀后用移液枪取出0.1 mL稀释至2 mL，再从2 mL中吸取20 μL放在载玻片上观察，重复3次。花粉活力检测采用0.5% TTC(氯化三苯基四氮唑)溶液染色法[8]，随机选取10朵花进行检测。每朵花随机选取10个分离的视野，每个视野不少于30粒花粉，统计视野中花粉的着色情况。活体花粉取自当天开放的花朵；离体花粉取自开花前一天的花苞，剥开花瓣露出花药，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，每天10时检测花粉活力。柱头活性测定采用联苯胺-过氧化氢法[9]，选取不同开花天数雌花各5朵进行检测，根据柱头先端产生的气泡数和染色深浅程度判定柱头活性的大小。取下雌花的子房，用解剖刀沿心皮突起边小心切下，于解剖镜下观察一个心皮内的胚珠数。

1.2.3 访问昆虫 访问昆虫采用定点观察法。观察时间为2016年3月20日至3月27日，观察时间9时至11时和15时至17时。记录访花昆虫的种类、数目和访问频率。拍照得到的访花昆虫图像由广东省农业科学院植保所徐海明博士鉴定。

1.2.4 授粉方法 每个枝条中部仅保留1朵花，花苞阶段套上硫酸纸袋，每个处理选择20朵花，处理如下：1)仅套袋，在花朵开放后一直套袋，观察是否存在无融合生殖；2)晴天人工授粉：在花朵开放的当天，于上午9时用毛笔蘸取花粉进行授粉，完成后马上套袋；3)雨天授粉：雨天待花开放后，用毛笔蘸取花粉进行授粉，结束后不再套袋；以不做任何处理为对照。处理后7 d调查授粉率和子房发育程度。

1.2.5 岗梅种子千粒质量、发芽率检测 参照《农作物种子检验规程》的方法，对不同批次岗梅种子的千粒重进行统计。随机取1000粒种子称重，重复3次，计算其平均值。

1.2.6 种子发芽率测定 岗梅种子需在一定温度条件下进行层积处理，完成其生理后熟和形态后熟才能萌发。2016年6月15日、20日、26日和30日分四批采收，采取除去果肉清洗干净，阴干后得到干净种子。2016年8月2日，将岗梅种子与经高温灭菌处理的湿沙按照1∶3的比例混合均匀，湿度为65%，置于25～30 ℃的室温下。2017年1月6日至7日以胚根突破种皮计算种子发芽率。

(1)

1.3 数据处理

将调查的数据采用Spss(version 22.0)进行统计，方差分析采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 岗梅开花期物候和开花结果特性

岗梅植株嫩叶和花蕾在3月上旬开始出现，3月中旬花蕾膨大，雄花约为2 mm，雌花约为1 mm；雌株花蕾的出现晚于雄株2～3 d。3月20日，雄花从枝条中下部至中上部陆续开花，3月24日进入始花期，3月26日进入盛花期，4月5日花期结束。雌株在3月24日有花开放，3月27日进入始花期，3月29日进入盛花期，4月4日花期结束。雌株开花顺序和雄株相似。5月下旬至6月上旬，雌花子房膨大约5～10 mm形成浆果。果皮颜色由绿色转变为紫红色。6月中旬约10%岗梅果实转变为紫红色，果肉变软进入成熟期，果实变软后2～3 d自然脱落。7月上旬约90%的岗梅果实脱落。广州中医药大学药王山上的雄株花期为4月7日至4月20日；而雌花的花期为4月10日至4月17日。

岗梅雄花花柄短，2～5 mm；3～5朵簇生，花白色，4～6瓣，覆瓦状排列，雄蕊4～6枚，花丝长5 mm，子房败育。雌花花柄长，8～20 mm；子房4～6室，柱头4～6裂，花药败育。雄株开花早于雌株4 d。

2.2 岗梅花粉活力

岗梅雄花有4～6枚花药，每朵花的花粉平均数量为16 587～21 717个，不同花的花粉粒数量差异较大。岗梅雌花具有4～6心皮，每心皮仅有1枚胚珠，发育成1个种子。花粉/胚珠比值(P/O)范围在16 587～21 717，为典型的异花授粉，充足的花粉保证授粉的成功率(表1)。

表1 岗梅花粉粒数目

岗梅单朵雄花的寿命在1～3 d，在温度较高、光照较强的情况下，花开放当天就自然脱落。阴雨天气，雄花在第2天或者第3天脱落。离体花粉活力在湿度为75%培养皿中，在开花前1天花粉达到70%，开花当天达到91%，开花第2天达到70%，第3天迅速下降到30%(表2)。

表2 岗梅花粉活力测定

注：—表示雄花未开放或已脱落，未检测花粉活力。

2.3 岗梅雌蕊柱头可授性

岗梅雌蕊柱头的颜色在开花后由浅绿色逐渐变为深绿色，并伴生有红色斑块，花柄从直立状逐渐下垂，形成离层，易脱落。柱头的可授性在开花后逐渐变弱。开花第1天，柱头气泡大量出现，颜色迅速变为深蓝色；开花第3天，花柄从直立状为下垂状，气泡数量变少，柱头变色时间增长，颜色变浅，柱头的可授性开始下降(表3)。花开放3～5 d后，花瓣开始脱落。

2.4 访问昆虫和授粉方法

岗梅植株开花过程，观察到少量的东方蜜蜂ApisceranaFabricius、麻蝇SarcophagafuscicaudaBöttcher等在花朵上停留，时间约1 s。其中多数造访雌花，雄花数量极少。岗梅花部未观察到明显的蜜腺存在。套袋结果显示，未能完成授粉的雌花在4 d后逐渐脱落。雄花在开花后2～3 d也自然脱落，不存在无融合生殖的现象。雨天人工授粉不成功。人工授粉率略高于自然授粉率。人工授粉后的雌花子房膨大速度超过自然授粉(表4)。

表4 不同授粉方法的授粉率和子房膨大速度(n=20)

注：-子房不膨大，+子房膨大正常，+++子房膨大速度较快。

表3 岗梅雌蕊柱头可授性(n=5)

注：+气泡数量或柱头可授性弱；++气泡数量多或柱头可授性强；++++气泡数量非常多或柱头可授性非常强。

2.5 岗梅种子千粒质量与种子发芽率

岗梅种子采收在6月中下旬完成，千粒质量、发芽率随着采收时间推迟而增加。6月15日采收种子的发芽率最低，为3%，千粒质量也仅为4.63 g；6月30日采收种子的发芽率最高，为10.25%，千粒质量为5.74 g。6月15日和6月30日采收种子千粒质量和发芽率达到显著性差异(表5)。6月20日和6月26日采收种子的千粒质量和发芽率的差异不显著，但与6月30日、6月15日采收种子千粒质量和发芽率差异具有统计学意义。相关性分析发现，岗梅种子采收期、千粒质量与发芽率之间呈极显著相关(表6)。

表5 不同采收期种子千粒质量及发芽率

注：不同小写字母表示P<0.05。

表6 岗梅种子采收期、千粒质量和发芽率相关性分析

注：**表示P<0.01。

3 结论与讨论

岗梅花原为两性花，但雄花子房败育退化为叶枕状，雌花花药败育为箭头状，形成单性花[10]。花粉/胚珠(P/O)比值也步表明岗梅为异花授粉植物。岗梅花被小、部分器官退化，花色白色，花粉量大，蜜腺不发达，具备典型风媒花特征[11]。次序开花且花期较长，这也是风媒花适应生态环境的策略。昆虫访问多数造访雌花，是否与传粉有关还需进一步研究。

风媒花的传粉受到环境影响较大，开花期物候中的雨季影响传粉质量[12]。通过2015年、2016年现场调查并参照历年气象记录，发现岗梅开花初期气温较高，3月下旬连续降雨达到5～6 d，且以午后阵雨较多，此时岗梅植株正值开花期，降雨可能影响岗梅种子授粉，雨天人工授粉不成功也表明雨水冲刷影响传粉质量。种子千粒重和发芽率随着采收时间推迟大幅度提高，进一步表明岗梅开花初期的降雨可能影响了前两批种子的授粉质量，导致种子发育程度较差，发芽率和千粒重较低。由于岗梅种子外面包被着果肉，难以从外表判断种子发育状况，因此建议岗梅种子在6月下旬采收，避开降雨时期形成的种子，从而确保良好的种子发芽率。