河北与山西产黄芩药材中主要黄酮类成分的含量比较研究

申洁，李珮，刘双双，李世，王继永，曾燕，刘海涛，何春年*，孙晓波，肖培根

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193；3.河北旅游职业学院，河北 承德 067000；4.中国中药有限公司，北京 100195

中药黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，在春秋采集，始载于《神农本草经》，目前为例版《中华人民共和国药典》所收录。其性寒、味苦，能清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎。现代药理学研究表明其主要活性成分为黄酮类化合物，如黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素等[1-2]，具有抗氧化[3-4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7-8]、保护肝脏和提高免疫[9-10]等多种药理活性。

据贾蔷等[11]报道，在《中药部颁标准》中有477个成方制剂中含有黄芩，包含主治疾病153种。黄芩药材临床用量较大，国内年需量达5000多吨[12]。随着黄芩资源需求量加大，野生资源已不能满足社会需求，栽培黄芩已成为我国黄芩药源的主要来源，国内已大量栽培。黄芩主要分布于长江以北大部分省区及西北和西南地区，现今习惯以河北承德为黄芩的道地产区，并认为河北承德黄芩药材质量较好[13]，其以仿野生栽培黄芩为主。另外，现以山西产量大，为人工栽培2～3年生黄芩的主要产区[14]。目前尚未有针对两地黄芩药材主要化学成分的对比研究。

为更加合理的评价河北与山西两个产区来源的黄芩药材的质量情况，本课题组系统的收集了河北省承德市的黄芩样品与山西省的黄芩样品共32份。采用多组分含量测定的HPLC-DAD的方法，测定了黄芩药材主要黄酮类化合物的含量，并比较了不同产地、不同年限、不同采收季节的黄芩药材主要黄酮化学成分含量的差异。为黄芩优质药材的综合评价进一步提供了相应的实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

32批黄芩样品均由本课题组采集或收集，原植物保存于药用植物研究所亲缘中心植物样品陈列室，由中国医学科学院药用植物研究所肖培根研究员鉴定。样品信息见表1。对照品野黄芩苷(3)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷(4)、黄芩苷(5)、木犀草素(7)、汉黄芩苷(8)、山姜素(9)、芹菜素(10)、黄芩素(11)、汉黄芩素(12)、白杨素(13)和千层纸素A(14)购于中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)、红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(2)、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(6)为本实验室从黄芩中分离得到，并经UV、IR、NMR等谱学数据鉴定，HPLC检测纯度大于95%，其中化合物(1)和(2)为C(2)-R，S构型混合物，混合比例为1∶1。甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher Scientific)；甲酸(CNW公司，德国)；纯净水(Milli-Q，Millipore 公司，美国)。

1.2 仪器

Agilent 1200 HPLC(G1322A型在线脱气机、G1311A型液相泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B型DAD检测器、Agilent色谱工作站)；梅特勒-托利多电子天平(AL204)；C9860A超声波清洗器(上海杰恩普超声设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

本实验方法采用已有的HPLC-DVD方法[15]，该方法基于HPLC-DAD多成分含量测定能够满足黄芩药材样品的测定，且仪器精密度、方法重复性、稳定性、对照品线性关系和加样回收率等均符合要求。色谱柱为YMC-pack ODS-A(250 mm × 4.6 mm，5m)；流动相为甲醇(A)、乙腈(B)和0.1%甲酸水(C)，梯度洗脱，线性洗脱程序为：0～60 min，A-B-C(15∶5∶80)到A-B-C(80∶10∶10)。每针进样分析完毕用初始流动相平衡15 min再进行下一针分析。流速为1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；紫外检测波长为278 nm；进样体积为10L。用安捷伦工作站Chemstation software(C.01.06)采集数据并分析。

2.2 供试品溶液的制备

取黄芩根部干燥样品，粉碎、过40目筛，精密称取粉末约0.5 g于50 mL的容量瓶中，精密加入相应体积的70%乙醇水，定容至刻度，超声提取30 min，放置室温，用70%乙醇水补足减少的体积，0.45m滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别精密称取14个对照品适量，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，得到各对照品的储备液。将各对照品的储备液各取适量后，置10 mL容量瓶中，混匀，并用甲醇定容置刻度，混匀后得混合对照品的储备液。所有的对照品溶液均储存在4 ℃。

2.4 样品测定

分别精密称取表1中的各份样品约0.5 g，按照2.2项下供试品溶液的制备方法进行处理，按照2.1项下所建立的分析方法进行测定，计算各样品中测得成分的含量，含量测定结果见表2。

表1 32批黄芩样品采集信息

2.5 黄芩药材中主要黄酮类化合物的含量比较

采于河北省承德县与山西省的共32批黄芩药材样品中，经与各标准品比对共指认9个黄酮类化合物，其他化合物未检出(黄芩药材代表性样品与标准品色谱图见图1)，该9个黄酮类化合物含量测定结果见表2。结果表明不同产区黄芩药材9个黄酮类化合物的含量差别较大，各黄酮的质量分数范围分别为：0.79～5.68 mg·g-1(1)、2.84～14.43 mg·g-1(3)、69.73～147.18 mg·g-1(5)、8.54～35.54 mg·g-1(8)、0.27～2.55 mg·g-1(9)、1.1～18.3 mg·g-1(11)、0.75～7.08 mg·g-1(12)、0.04～1.32 mg·g-1(13)、0.09～2.14 mg·g-1(14)。化合物含量高低顺序依次为黄芩苷(5)>汉黄芩苷(8)>黄芩素(11)>野黄芩苷(3)>汉黄芩素(12)>异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)>千层纸素A(14)>白杨素(13)。

注：1.异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；2.红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；3.野黄芩苷；4.芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷；5.黄芩苷；6.白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；7.木犀草素；8.汉黄芩苷；9.山姜素；10.芹菜素；11.黄芩素；12.汉黄芩素；13.白杨素；14.千层纸素A。图1 黄芩代表性样品(A)与对照品(B)叠加谱图

表2 32批黄芩药材样品中主要黄酮类化合物含量测定结果 mg·g-1

续表2

2.5.1 河北产区与山西产区黄芩药材的黄酮含量对比分析 对实验数据进一步进行统计，分析了不同产区、生长年限、采收季节这些因素对黄酮类化合物含量的影响，不同产区黄芩药材的黄酮含量对比分析结果见表3。该统计学分析结果表明，河北产区和山西产区黄芩药材中所测得的野黄芩苷与千层纸素A的含量在两个地区间存在显著差异。另外，两地区测定的黄酮总含量不存在显著性差异。说明两地黄芩药材测定的黄酮总含量存在一定的一致性，但从单体黄酮类化合物含量角度出发，两地黄芩药材质量却存在一定的差异性。

表3 不同产区黄芩药材中主要黄酮类化合物含量对比分析 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一浓度不同字母代表在P<0.05水平差异具有统计学意义。

2.5.2 不同生长年限黄芩药材的黄酮含量对比分析 不同生长年限黄芩药材的黄酮含量测定结果见表4，3年生黄芩药材的黄芩苷、汉黄芩苷含量较高，且与其他年限生长黄芩药材间存在显著性差异；不同生长年限黄芩药材中黄酮类化合物：异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、山姜素、白杨素、千层纸素A的含量无显著性差异；3年生黄芩药材的野黄芩苷含量与2年和7年生的黄芩药材存在显著差异，而与1年生黄芩药材中的含量相近，无显著差异；7年生黄芩素和汉黄芩苷的含量与其他生长年限的黄芩药材，含量较高且存在显著差异。化合物异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、山姜素、黄芩素、千层纸素A的含量，3年生>2年生>1年生，随着年限的延长含量呈上升趋势。测定的各黄酮总含量，3年生黄芩药材最高，1年生与2年生黄芩药材总量相近。

2.5.3 不同采收期黄芩药材的黄酮含量对比分析 不同采收时期黄芩药材的黄酮含量测定结果见表5，结果显示化合物野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的含量在春季和采收的黄芩根部中有显著性差异，其在春季采收时含量更高。其他5种黄酮类化合物在不同采收期黄芩药材中的含量相近，无显著性差异。春季采收的测得各黄酮总含量与秋季的存在显著性差异，且前者高于后者。

表4 不同生长年限黄芩药材的黄酮含量测定结果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一浓度不同字母代表在P<0.05水平差异具有统计学意义。

表5 不同采收时期黄芩药材的黄酮含量测定结果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一浓度不同字母代表在P<0.05水平差异具有统计学意义。

3 讨论

3.1 黄芩药材样品的采集

黄芩药材样品的采集地点的选择合适：产于河北省承德市的热河黄芩是目前普遍认为的道地药材，在20世纪30年代，《药物出产辨》已有记载“直隶、热河一带均有出”，而山西虽为非道地黄芩产区，却为2～3年生黄芩药材的主产区[16]；本研究黄芩样品采集较为全面和典型：黄芩道地药材样品收集全面，系统性的收集了河北省承德市各县的黄芩药材。非道地产区山西则主要采集产量较大的晋中与晋南地区的黄芩药材样品。

3.2 测定结果分析

本课题组利用建立的测定黄芩植物主要黄酮类化合物的HPLC方法，测定了河北与山西不同产地、不同年限、不同采收季节的黄芩药材的9个黄酮类化合物的含量，并系统地分析了彼此间的差异性。河北省承德市与山西产区的黄芩药材中野黄芩苷和千层纸素A的含量存在显著性差异。另外，综合两个产地测定结果发现，不同生长年限的黄芩药材中黄酮类化合物的含量存在一定的差异性，其中3年生黄芩药材的黄芩苷、汉黄芩苷含量较高，与1年生、2年生和7年生的黄芩存在显著性差异。根据测得黄酮类化合物的总含量结果，发现3年生>7年生>1年生和2年生，3年生的黄芩药材品质较好，但在黄芩药材产区却以2～3年生黄芩为主，推测因考虑到经济效益和产量，为在保证质量的基础上，大多产区选择种植2～3年生的黄芩。对河北省承德地区不同采收季节黄芩药材黄酮类化合物的含量测定结果显示，春季采收的黄芩根部中野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的含量高于秋季采收的黄芩，春季采收的黄芩药材各黄酮总含量也高于秋季采收黄芩，春季采收的黄芩药材质量较优，这可为黄芩药材的采收季节提供一定的参考。

据2015版《中华人民共和国药典》规定的黄芩药材按干燥品计算，含黄芩苷不得少于9.0%，但在本研究中发现，若以黄芩苷含量多少为标准评判药材质量的优劣，不论在黄芩药材传统道地产区河北省承德市还是非道地产区山西省，都存在一些样品不合格的现象，这虽从侧面反映了黄芩药材存在的质量不均一的情况，但以单一成分评价药材质量是否合理需要进一步的深入研究。因此为保证药材品质，需要规范黄芩种植，确定黄芩药材的最佳采收年限和采收期，也需要更科学的方法评价黄芩药材的品质，本实验为此提供了一定的参考和科学依据。