生脉注射液UPLC特征指纹图谱及11种成分定量分析△

柴瑞平，路娟，吕欣锴，俞月，赵颖，陈曦

北京协和医学院 中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193

生脉注射液是我国古代经典名方“生脉散”经现代工艺精制而成的中药注射液，是中药现代化的重要药物之一。该药由红参、麦冬、五味子3味中药材制得，临床上常用于辅助治疗脓毒症、感染性或心源性休克及其他心脑血管类疾病[1-3]，疗效确切，不良反应报道相对较少，使用量大，因此对生脉注射液进行全面质量控制显得尤为重要，以期为临床安全提供参考。

研究者多采用高效液相色谱法及液质联用法(HPLC/UPLC-MS)对生脉注射液的特征成分进行分析，现有的指纹图谱标定共有峰数量不多，多种成分分离效果不够理想，尚未建立对3味中药材不同成分同时测定的方法[4-7]。3味中药材分别具有多种代表性活性成分，红参中人参皂苷类成分在体内、体外均表现出良好的抗炎活性，可明显抑制NO分泌，减少炎症相关基因的mRNA表达，其机制可能与调控IRF3等通路有关；麦冬皂苷D可通过缓解内质网应激损伤从而对阿霉素致心肌损伤小鼠产生一定的保护作用；五味子醇甲具有一定的抗炎免疫作用[8-10]。多成分多靶点协同发挥药效是中药复方制剂的特色优势，生脉注射液中多种成分具有抗炎抗氧化及逆转组织损伤的药理作用，因此对生脉注射液化学成分进行更全面地研究显得尤为必要。

本研究采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器法(UPLC-DAD)建立了生脉注射液全新的指纹图谱方法，在35 min内分离数十种成分，同时找到了红参、麦冬、五味子3味中药的代表性成分，方法快捷简单，稳定可靠，为进一步查找该药药效物质基础提供了完整的实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪，配置四元高压泵、自动进样器、PDA检测器；Mettler AB265-S电子分析天平；优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司)；SB25-12DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)

1.2 试药

对照品人参皂苷Rb1(批号171018)、人参皂苷Rb2(批号171009)、人参皂苷Rd(批号170530)、人参皂苷Re(批号170924)、人参皂苷Rf(批号171126)、人参皂苷Rg1(批号180105)、麦冬皂苷D(批号171126)、五味子醇甲(批号180109)、五味子酯甲(批号171231)均购自上海融禾医药科技有限公司；人参皂苷Rb3(批号111686-201504)、人参皂苷Rg2(批号111779-200801)购于中国食品药品检定研究院，以上对照品纯度均在98.0%～99.7%；乙腈、甲醇(色谱纯，默克)；水(屈臣氏牌蒸馏水)。

生脉注射液共9批次，分别来源于5个不同的厂家，药品信息见表1。

表1 不同批次生脉注射液药品信息 mL/支

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称定人参皂苷Rb1对照品9.49 mg，人参皂苷Rb2对照品10.22 mg，人参皂苷Rb3对照品6.69 mg，人参皂苷Rd对照品6.24 mg，人参皂苷Re对照品6.24 mg，人参皂苷Rf对照品7.35 mg，人参皂苷Rg1对照品13.24 mg，人参皂苷Rg2对照品6.58 mg，麦冬皂苷D对照品5.12 mg，五味子醇甲对照品5.60 mg，五味子酯甲对照品3.27 mg，置于5 mL容量瓶中，加入一定量纯甲醇，超声至完全溶解，放置至室温后定容，作为对照品储备液待用。

分别精密吸取一定量对照品母液，置于5 mL容量瓶，定容、摇匀后，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取生脉注射液样品轻轻摇匀后，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，编号同表1。

2.2 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱程序见表2，流速为0.3 mL·min-1，全波长扫描(190～400 nm)，柱温为40 ℃，进样量为5 μL。样品及混合对照品色谱图见图1。

表2 定性定量色谱条件的流动相及比例

注：A.S1生脉注射液样品；B.混合对照品；10.人参皂苷Rg1；11.人参皂苷Re；15.人参皂苷Rf；19.人参皂苷Rb1；20.人参皂苷Rg2；22.人参皂苷Rb2；23.人参皂苷Rb3；24.五味子醇甲；25.人参皂苷Rd；37.麦冬皂苷D；39.五味子酯甲。图1 提取210 nm波长下生脉注射液UPLC图

2.3 指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 取S1批次生脉注射液(批号：16120401005)的供试品样品，连续进样5次，色谱条件同2.2，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于2%，表明该色谱仪精密度符合要求。

2.3.2 稳定性试验 取S1批次生脉注射液(批号：16120401005)的供试品样品，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，色谱条件同2.2，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于2%，表明该色谱仪稳定性符合要求。

2.3.3重复性试验 取批号为16120401005的生脉注射液供试品样品，共6份，进样条件不变，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于1%，表明该色谱仪重复性符合要求。

2.3.4 参照峰选择与共有峰标定 在9批次生脉注射液供试品指纹图谱中，五味子醇甲色谱峰分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间合适，故确定24号五味子醇甲色谱峰为参照峰。

将9批次生脉注射液UPLC指纹图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版进行色谱峰匹配，经处理后共标定44个共有峰，并确定11个共有峰，分别为人参皂苷Rg1(10号峰)、人参皂苷Re(11号峰)、人参皂苷Rf(15号峰)、人参皂苷Rb1(19号峰)、人参皂苷Rg2(20号峰)、人参皂苷Rb2(22号峰)、人参皂苷Rb3(23号峰)、五味子醇甲(24号，S)、人参皂苷Rd(25号峰)、麦冬皂苷D(37号峰)、五味子酯甲(39号峰)，见图2～3。

图2 9批次生脉注射液UPLC指纹图谱

图3 指纹图谱对照图谱

2.3.5 相似度评价 利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版软件计算分析，9批生脉注射液供试品色谱图中色谱图相似度均>0.91，具体数据见表3，表明批次间差异较小，制备工艺较为稳定，方法准确可靠。

2.4 生脉注射液多指标成分定量分析

2.4.1 线性关系考察 精密吸取各对照品储备溶液配制混合对照品溶液，将混合对照品溶液按比例稀释成一系列梯度浓度的混合对照品溶液，按2.2项色谱条件进样测定，记录液相色谱图。以各成分色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，制作标准曲线，回归方程等见表5。

表3 不同批次生脉注射液相似度比较

表5 生脉注射液指标成分回归方程、峰面积与浓度相关系数(r)及线性范围

2.4.2 精密度试验 取同一对照品溶液，连续进样6次，进样条件不变，记录色谱图，测定峰面积，计算11种成分的精密度。结果RSD为0.20%～1.11%，表明该色谱仪精密度良好，符合含量测定要求。

2.4.3 稳定性试验 取同一批生脉注射液(批号：16120401005)的供试品样品，分别于0、2、4、6、8、12、20、24 h进样，进样条件不变，记录色谱图，测定峰面积，计算结果RSD为0.53%～1.34%，表明样品溶液于24 h稳定性良好，符合含量测定要求。

2.4.4 重复性试验 取同一批生脉注射液(批号：16120401005)的供试品样品，共6份，平行制备供试品溶液，进样条件不变，记录色谱图，测定峰面积。结果RSD 为0.59%～1.45%，表明该色谱仪重复性良好，符合含量测定要求。

2.4.5 加样回收率试验 取同一批生脉注射液(批号：16120401005)的供试品样品，共6份，每份取2.5 mL于5 mL容量瓶中，加入混合对照品溶液适量，加纯水至刻度后制得供试品溶液，进样条件不变，记录峰面积及色谱图。结果人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、麦冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲平均回收率分别为105.25%、99.83%、110.06%、109.43%、98.02%、104.41%、97.89%、111.20%、98.76%、102.76%、108.91%，RSD值分别为3.11%、2.56%、1.89%、2.49%、2.71%、3.04%、2.12%、1.56%、1.91%、2.06%、2.00%，表明本方法准确可靠，符合含量测定要求。

2.4.6 含量测定 取9批次生脉注射液，按2.2项色谱条件进行测定，分别在各成分最大吸收波长处提取峰面积进行计算，测得样品中11种成分的含量，结果见表6。9批次样品的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、麦冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲的含量分别为56.99～101.69、20.63～44.63、2.79～5.05、13.99～30.09、41.52～62.10、8.24～16.94、80.00～88.99、4.14～9.69、1.28～3.42、29.05～73.09、2.61～4.85 μg·mL-1。

3 讨论

3.1 指纹图谱提取波长的选择

本研究中采用全波长扫描(190～400 nm)，综合考虑人参皂苷类成分、麦冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲最大吸收波长分别为：203、208、210、216 nm，最终选择210 nm作为指纹图谱的提取波长，此波长下各成分峰形良好，基线平稳，符合指纹图谱相关要求[11-13]。

3.2 色谱条件的优化

在流动相种类与比例优化过程中，本研究先后考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水系统，结果以乙腈-水为流动相的条件下，实验得到的色谱峰数量较多，分离度较佳，经梯度洗脱可将绝大多数成分成功分离，控制洗脱时间于35 min，对于中药复方制剂来说，因成分种类复杂，该时长相对合理快速；柱温对色谱峰分离存在一定影响，本研究通过考察25、30、40 ℃，发现40 ℃条件下，各峰分离度为最佳，不会出现峰包裹的情况[14]。

表6 各成分含量测定结果(n=3) μg·mL-1

3.3 样品测定结果分析

结合UPLC指纹图谱与多成分含量同时测定的方法，本研究发现，不同厂家9批次生脉注射液质量一致性较好，总体差异较小，说明生脉注射液的制备工艺稳定，质量可控性良好。其中一个厂家的生脉注射液的五味子醇甲含量高于其他厂家的产品，可能与药材采收的地点、时间等因素有关[14]，因此同一厂家多批次药品进行质量一致性评价也显得尤为重要[15]。故提升生脉注射液质量标准，首先要优化现行色谱条件，五味子醇甲等成分也应考虑作为质量评价指标之一，含量限度则应综合不同品牌液相的方法耐用性考察及高分辨质谱的测定结果共同制定。

4 总结

本研究利用UPLC法，在同一色谱条件下，建立了生脉注射液指纹图谱，系统判定的44个共有峰，整体反映了其化学成分特征，同时在35 min测定了人参皂苷Rb1等11种活性成分的含量，将模糊鉴别与精准定量分析相结合，能系统快速地对生脉注射液进行质量评价。中药注射液安全使用问题自该剂型面世以来备受关注，对中药注射液化学概貌研究不仅可以用于评价不同企业的药品生产工艺是否稳定可控，还对临床使用具有十分重要的警示作用，避免对某种中药甚至某种成分存在不良反应史的患者使用，降低临床风险，为“中医药精准医疗”提供合理思考[16]。