利用苦水玫瑰花渣提取总黄酮可行性分析

王 刚 姚 雷 （上海交通大学农业与生物学院，上海市闵行区 200240）

李正娟 （上海聚公生物科技有限公司，上海市金山区 201505）

玫瑰属蔷薇科蔷薇属植物，其中苦水玫瑰为我国独有品种，在我国已有200多年的种植历史，该品种主要分布在甘肃省兰州市永登县苦水镇[1]。长期以来，提取玫瑰精油是我国玫瑰的主要用途。近年来，由于精油市场紧俏，精油生产量上升，随之带来了其副产物花渣的排放量加大，这不仅给环境带来了影响，还因花渣中可能含有大量的活性天然产物而造成巨大的资源浪费。大量研究发现，作为生产精油副产物的玫瑰花渣，富含多糖、蛋白质、氨基酸、粗纤维、黄酮和多酚等活性物质，其中，黄酮含量占3.13%[2]。而黄酮类化合物具有多种医疗保健功能，是目前国际上开发新药物的研究重点。

目前，针对苦水玫瑰的研究主要集中在抗氧化成分的提取、纯化及抗氧化活性研究，缺乏对苦水玫瑰花渣中有效成分利用价值的研究。因此，本研究从利用苦水玫瑰花渣提取总黄酮的可行性入手，采用硝酸铝比色法对其总黄酮的含量进行比较研究，同时采用液质联用技术对其黄酮类化合物的组成成分进行分析和鉴定，以期为苦水玫瑰花渣的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为苦水玫瑰干花和大马士革玫瑰干花，均购于甘肃省兰州市永登县。供试药剂为无水乙醇、无水甲醇（均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司）和甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯，购于上海凌峰化学试剂有限公司）。仪器设备为101A-2电热鼓风干燥箱（上海实验仪器总厂）、BJ-150高速多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）、JA1003上皿电子天平（上海精科天平）、3K15型sigma台式高速冷冻离心机（上海珂淮仪器有限公司）、CU420电热恒温水箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SK7200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（SHIMADZU公司）、VION IMS QTOF MS超高效液相色谱-离子淌度-四极杆飞行时间质谱联用仪（SHIMADZU公司）。

1.2 总黄酮含量的测定

1.2.1 玫瑰花渣的制备

称取苦水玫瑰干花和大马士革玫瑰干花各500 g，采用水蒸气蒸馏法提取精油，将精油除去后，经纱布过滤除去废水后残留的浸渣即为玫瑰花渣。将浸渣置于干燥箱中，先于105 ℃下干燥15 min，再于70 ℃下烘干直至恒重。取恒重后的玫瑰花渣，经多功能粉碎机粉碎，过60目筛后收集干粉，于冰箱中冷藏保存，备用。

1.2.2 玫瑰花渣总黄酮粗提液的制备

用分析天平准确称取苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣各0.500 0 g，加入一定体积的70%乙醇，置于65 ℃的恒温水浴中加热提取1 h后，再采用超声波辅助提取20 min，之后将各粗提液置于离心机中离心20 min，转速设置为10 000 r/min，收集滤渣，再次提取，将两次经离心得到的上清液合并，得到总黄酮提取液。

1.2.3 芦丁标准曲线的制作

精确称取芦丁标准品0.020 0 g于烧杯中，加入一定浓度的乙醇溶液进行溶解，制备得到0.2 mg/mL芦丁标准溶液，置于4 ℃的冰箱中，但搁置时间不能太长。准确量取芦丁标准溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别倒入6个棕色容量瓶中（体积10 mL），再向各个容量瓶中分别加入70%乙醇溶液2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，然后每个容量瓶中精密加入5% NaNO20.5 mL，混合均匀后于暗处静止放置6 min，之后再向各个容量瓶中分别加入10%Al(NO3)30.5 mL，混合均匀后于暗处静止放置6 min，最后向各瓶添加5%NaOH 4 mL，再向各瓶添加70%乙醇定容至刻度线，混合均匀后于暗处静止放置15 min，在紫外-可见分光光度计上测定510 nm波长处的吸光度值，最后绘制标准曲线。

1.2.4 总黄酮含量的测定

准确吸取苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣的总黄酮粗提液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，按照1.2.3的方法测定各个溶液的吸光度。根据1.2.3得到的曲线方程计算得出各玫瑰总黄酮的质量浓度，然后计算各自的含量。计算公式：玫瑰总黄酮的含量（mg/g)=(C×V×N)÷M，式中，C为各粗提液中玫瑰总黄酮的质量浓度（mg/mL），N为提取液的稀释倍数，V为提取液体积（mL），M为原材料的质量（g）。

1.3 黄酮结构的测定

本研究采用液质联用法对总黄酮的结构进行分析鉴定。

质谱条件：仪器为ACQUITY UPLC级系统、VION IMS QTOF质谱仪和DAD检测器。

超高效液相色谱条件：采用的流动相A是0.1%甲酸水溶液，流动相B是0.1%甲酸乙腈，采用线性梯度洗脱。注射量为0.1～1μm，流量为0.4 mL/min，温度为45 ℃。

VION IMS QTOF MS的具体条件：采用正、负电喷雾电离(ESI)模式对LockSpray离子源进行工作。在50～1 000 m/z范围内扫描，扫描速率为0.2 s/scan。用氩气（99.999%）作为碰撞诱导解离气体。

电喷雾震源参数：毛细管电压2 kV（正模式）、参考毛细管电压2.5 kV、锥电压40 V、源偏移量60 V、热源温度115 ℃、脱溶剂气体温度450 ℃、脱溶剂气体流量900 L/h、锥孔反吹气流量50 L/h，其中脱溶剂气体和锥孔反吹气体是氮气（＞ 99.5%）。

1.4 数据处理方法

采用Excel软件整理数据，使用UNIFI 1.8.1.软件计算。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量的比较研究

由图1可知，芦丁标准曲线方程为y=6.075x+0.001，R2=0.9995。依据芦丁标准曲线方程和总黄酮含量计算公式获得苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣的总黄酮含量分别为72.24 mg/g和43.82 mg/g，苦水玫瑰花渣的总黄酮含量几乎是大马士革玫瑰花渣中的2倍。以上结果表明，苦水玫瑰花渣中含有丰富的黄酮类化合物，表明在黄酮含量方面，苦水玫瑰花渣具有重要的研究价值和经济效益。

图1 芦丁标准曲线

2.2 黄酮结构的比较研究

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术能够得到待测黄酮的总离子流色谱图、黄酮组分的一级和二级质谱图，且从中可得到准分子离子的分子量，并能分析计算出可能的分子式，同时还可得到可能的相应化合物及其结构。由图2可知，图谱显示的分子离子峰较多，且每个峰的响应值不同，这表明苦水玫瑰花渣中黄酮的组成成分较多，且不同组分的含量差异较大。同时，图谱上响应值较高的有十几种，根据这些组成成分的一级、二级质谱图所显示的分子量、特征碎片离子和可能的结构，再结合已报道的文献，可以初步判定出各个组分的结构，最终从玫瑰花渣的总黄酮中初步确定出13种含量较高的化合物，包括6种槲皮素的糖苷衍生物和7种山奈酚的糖苷衍生物，见表1。

由图3可知，苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣含有相同的黄酮类化合物，但含量不同；苦水玫瑰花渣中含有大马士革玫瑰花渣中没有的黄酮类化合物；大马士革玫瑰花渣中含有苦水玫瑰花渣中没有的黄酮化合物。在20 000水平线以上峰值中，苦水玫瑰花渣黄酮峰值大于大马士革玫瑰花渣黄酮峰值的数量为23个，大马士革玫瑰花渣黄酮峰值大于苦水玫瑰花渣黄酮峰值的数量为10个，在峰值数量上，苦水玫瑰花渣占有明显优势，表明这两种玫瑰花渣黄酮的结构有较显著的差异。

图2 苦水玫瑰花渣中黄酮的总离子流色谱图

表1 玫瑰花渣中主要的黄酮类化合物

本研究同时根据峰的保留时间、分子离子峰质荷比、特征碎片离子、分子式和黄酮化合物的裂解模式，着重研究分析了苦水玫瑰花渣中含有（响应值相对高的）而大马士革玫瑰花渣中没有的黄酮结构。由表2可知，仅存在于苦水玫瑰花渣中的黄酮类化合物主要是槲皮素和山奈酚的糖苷物质。

图3 苦水玫瑰花渣与大马士革玫瑰花渣黄酮的总离子流色谱对比图

表2 苦水玫瑰花渣中独有的4种黄酮类化合物

3 结 论

本研究采用硝酸铝比色法对苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣的总黄酮含量进行了比较，其含量分别为72.24 mg/g和43.82 mg/g；同时，应用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对苦水玫瑰花渣和大马士革玫瑰花渣中黄酮的组成成分进行了初步分析和鉴定，发现两种玫瑰花渣中提取的黄酮结构有较显著差异，有4种含量较高的黄酮结构仅存在于苦水玫瑰花渣中。以上研究表明，利用苦水玫瑰花渣提取总黄酮在黄酮含量和结构方面均具有一定的可行性。