拟南芥生态型Zu-0减少主茎分枝的遗传机理探究

张 强，潘芳芳，蔡晓芸，荀道健，张 宁，李 鑫，黄雪清

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438; 2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

分枝在植物形态建成中占有十分重要的地位.高等植物的分枝发育决定着植物地上株型系统，并与其适应环境的能力密切相关，直接影响植物的生存竞争能力；同时分枝也是影响作物生物量和结实量的重要农艺性状[1].通常农作物的分枝通过影响作物结实的多少来影响产量，比如水稻通过控制有效分蘖数目的多少来提高产量[2]，而玉米则在驯化过程中通过减少侧枝数而增加产量[3].在实际生产中人们通过棉花整枝，果树修剪，增加水稻和小麦分蘖数，减少玉米分枝数等措施来达到增产的目的.因此彻底阐明植物分枝发育的调控机理，将有助于通过分子生物学手段来改良植物的株型结构，从而提高作物产量，增加植物观赏性等，在农业生产上具有重要意义[4].

植物的茎干系统是由胚胎发育时期的主茎顶端分生组织(Shoot Apical Meristem, SAM)以及种子萌发后形成的其他分生组织形成的.通常植物分枝的形成需两步完成： 叶腋分生组织起始后形成腋芽和腋芽的生长[5].植物的侧枝发生在位于主茎轴叶片的叶腋部位，叶腋分生组织(Axillary Meristem, AM)起始后形成腋芽(侧芽)(axillary bud)，随后，腋芽有可能继续生长形成一个侧枝，但也可以进入休眠状态.这两种状态可以相互转换，休眠的腋芽可以被环境信号或响应发育程序重新激活，进而生长成侧枝；活动状态下的腋芽，也可能由于不利其发育的因素而转变为休眠芽.因此植物最终的分枝程度不仅取决于叶腋分生组织的数量，还取决于腋芽的最终激活生长数.

近十几年来，人们在番茄(Solanumlycopersicum)、豌豆(Pisumsativum)、矮牵牛(Petuniahybrida)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中相继发现了一系列可以调控侧芽形成以及打破侧芽休眠后期生长的关键基因.按照叶腋分生组织形成的过程可以将这些相关基因分为三大类.第一类是与叶腋分生组织起始相关的基因，包括番茄的LS[6]、BL[7]、GOB[8]，拟南芥的LAS[9]、RAX1-3[10]、REV/IFL1[11]、CUC1-3[12]、ROX[13]，水稻的MOC1[14]、LAX[15]，玉米的BA1[16].这类基因一旦突变则不能形成叶腋分生组织[1].第二类是与侧芽生长发育相关的基因.属于这类基因的有拟南芥的AXR1[17]、BRC1[18]、MAX1-4[1]，玉米的TB1[3]，豌豆的RMS1-6[19-20]，矮牵牛的DAD1-3[21-22]以及水稻的D3[23]、HTD1[24-25]、D10[26]、FC1[27].这类基因隐性突变后，不影响侧芽数量，但不再抑制侧芽的活性，使得侧芽打破休眠开始后期生长，这也使得这些突变体的分枝数量远多于野生型[5].第三类是与叶腋分生组织起始和后期生长相关的基因.现发现拟南芥中SPS[28]属于这类.相较于野生型，该基因突变体会有非常多的分枝，究其原因： 一是在一个叶腋位置会产生多个叶腋分生组织；二是该基因的突变解除了对腋芽的抑制，使得腋芽生长成为分枝.

植物分枝发育，其涉及的调控途径多，存在着许多的上位效应，诱导突变已无法满足其全面研究.而拟南芥的不同生态型中存在着许多自然遗传变异，这些变异是拟南芥遗传研究中巨大的突变体库[29]，利用QTL(Quantitative Trait Locus)定位分析，通过等位基因重组，使得发现这些被上位效应所掩盖的基因的可能性大大增加.对分枝性状进行QTL定位分析，能够从整体上了解调控侧枝的影响因素，发现新的基因位点，如Ungerer等定位到与分枝数相关的QTL-DF.184在第五染色体[30]；El-Lithy等定位到6个与主茎分枝数相关的QTL和4个与莲座分枝相关的QTL[31].Huang等利用AMPRIL群体检测到8个减少主茎分枝的QTL[32].

已有的研究发现，减少主茎分枝(Reduced Stem Branching, RSB)表型与开花时间密切相关，RSB表型只出现在晚花植株中.由于实验室常用的拟南芥生态型Col、Ler、Ws等均为早花背景，加上较低的自然变异率，在晚花背景的拟南芥生态型中，RSB表型也较为罕见.Kalinina等曾在2002年报道起源于瑞士的拟南芥生态型Zurich-0(Zu-0)也有相似的RSB表型，主茎上缺少分枝，叶腋处没有AM[33].但迄今为止Zu-0中有关RSB表型的分子遗传机制尚未被报道.我们将其和Col-0杂交构建重组自交系(Recombinant Inbred Lines, RIL)群体，以期找到新的有关RSB的QTL，为进一步了解分枝形成的分子遗传机制提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料

实验所使用的植物材料主要是拟南芥Col-0(Columbia-0)生态型和Zu-0(Zurich-0)生态型为亲本构建的重组自交系群体.这些材料均由本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的种植

拟南芥种子4℃春化2～3d后，点播在吸好水的混合营养土表面，覆盖保鲜罩以保持湿度，在温室(温度22℃，湿度60%，光周期： 16h光照/8h黑暗)中培养，等发芽后取下罩子，10周左右果荚呈褐黄色并开裂，可收取种子.

1.2.2 构建RIL群体

Col-0×Zu-0杂交得到的F2代种植237株，种植后每个单株均自交，得到有效F4代植株共192株，最终在F4代建立含有192株的RIL群体.

1.2.3 RSB表型统计方式

拟南芥始花后一周左右，测定主茎上的侧枝数和叶腋数，RSB=主茎分枝数/主茎叶腋数，RSB=0代表主茎上没有分枝，RSB=1代表主茎每个叶腋都长出了侧枝.

1.2.4 分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)鉴定基因型

由于调控花期的基因和控制着主茎分枝数的基因存在着一些上位效应[32,34]，RSB频率分布统计图并不是标准的正态分布，故利用BSA(晚花遗传背景下选择多侧枝(RSB=1)和无侧枝(RSB≈0)作为2个基因池(gene pool))筛选与RSB性状相关紧密连锁的分子标记，再使用Duncan test统计分析将这些紧密连锁的分子标记在晚花背景下的群体中进行标记-表型连锁分析验证，得到初定位QTL.

1.2.5 物理图谱构建

使用Map Chart作图软件，根据已筛选出的双亲间具有多态性SSR分子标记，及该分子标记所在的染色体及物理位置，绘制Col-0×Zu-0群体的物理图谱.

1.2.6 总RNA提取和实时定量RT-PCR分析

将已在短日照下生长28d的植株，移至长日照下，取叶腋尖端带提取总RNA.根据植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)的使用说明提取RNA，总RNA保存在-80℃，总RNA用M-MLV(TaKaRa)反转录成cDNA后，保存在-20℃.实时定量PCR使用的试剂为SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)，定量实验在Bio-Rad CFX96TM仪器上运行，得到数据后分析.

1.2.7 QTL定位结果的验证

从RIL群体中挑选出只在各自目标QTL区杂合而在其他QTL区纯合的株系，通过自交构建杂合自交家系(Heterogeneous Inbred Families, HIF)群体.统计HIF各株系的RSB性状，并鉴定其基因型，验证QTL的等位基因效应.

2 结果与分析

2.1 亲本及F4群体RSB性状表型值的描述性统计

我们对Zu-0生态型和Col-0生态型进行了RSB性状的表型值测定和相关的分析.如图1所示，Zu-0主茎上的叶腋基本上没有长出侧枝(RSB平均值为0.24，n=25)；与Zu-0相比，Col-0主茎上的叶腋处大都长出了侧枝(RSB平均值为1，n=32)，说明RSB表型在双亲之间差异比较明显.

1) 所统计株数均≥15株，使用Duncan test统计分析，P<0.05.

此外，我们对F4群体RSB表型均值频数分布分析(图2(a))，RSB性状在F4群体中并不呈现正态分布.这是因为花期与分枝形成存在着上位效应[32].两亲本的开花时间具有明显差异，Zu-0比Col-0平均晚40d开花(表1).该群体的早花的植株的RSB均为1，只有晚花植株的RSB出现分离(图2(b)).因此，我们利用BSA法来进行QTL初定位.

图1 Zu-0和Col-0关于RSB性状的比较Fig.1 Comparison of the RSB phenotype between Zu-0 and Col-0箭头表示其主茎大部分叶腋处没有分枝.

图2 F4群体RSB表型分析Fig.2 Analysis of RSB phenotype in F4 population(a) RSB表型在F4群体中的频率分布图；(b) 在F4中，花期和RSB的性状分离.

2.2 拟南芥物理图谱的构建及RSB性状QTL的定位与遗传分析

在F4中，晚花遗传背景下，挑选出多侧枝(RSB=1)和无侧枝(RSB≈0)，各12株，提取基因组DNA，混合，组成Zu-0池和Col-0池.从Tair中(http：∥www.arabidopsis.org/)选出均匀覆盖拟南芥全基因组5条染色体的SSR引物，筛选出71个在两亲本之间存在多态性的SSR分子标记.按照各SSR在Col生态型基因组序列中的物理位置，绘制出物理图谱(图3).71个SSR分子标记覆盖拟南芥5条染色体，每条染色体上的标记数目在12～19之间，平均每条染色体上有14.2个标记；物理图谱总长度119.63Mb，相邻两个标记间的平均图距为1.7Mb，最大图距为3.3Mb，最小图距为0.5Mb.用这71个标记在两基因池中鉴定出与RSB性状相关紧密连锁的分子标记有13个，然后再用这13个分子标记对F2群体做标记-表型连锁分析，以排除假阳性标记.最终定位到与RSB性状相关的4个QTL，分别是qRSBZu-1(位于2号染色体末端，跨度3.0Mb)、qRSBZu-2(位于4号染色体上端，跨度2.7Mb)、qRSBZu-3(位于5号染色体上端，跨度3.7Mb)、qRSBZu-4(位于5号染色体中下部，跨度4.2Mb)(图3).

图3 物理图谱及与RSB性状相关QTLFig.3 The physical map and QTL which showed significant correlation with RSB phenotype

2.3 QTL定位结果的分析和验证

对4个QTL进行初步分析后，发现qRSBZu-1区域含有与已知的减少分枝形成相关基因AGL6[34]，但对Zu-0AGL6的ORF测序，并没有在其外显子中找到有义突变，我们进一步测定了AGL6在生殖生长发育不同时期的表达量(图4)，发现Col-0和Zu-0之间并没有明显的差异，因此我们推测在qRSBZu-1中是其他基因引起了RSB性状.

图4 AGL6在形态发育阶段的相对表达量Fig.4 The relative expression level of AGL6 in different development stage总RNA提取于拟南芥发育的不同时期的经过短日照到长日照处理的SAM，ACTIN8作为内参.

在qRSBZu-2中包含了FRI[35]，qRSBZu-3包含了FLC[36-37]，FRI和FLC是开花时间调控的关键基因，它们控制开花时间的同时也调控减少主茎分枝表型[32].在本研究中，亲本Zu-0是晚花生态型，Col-0是早花生态型，在它们的F2群体中，早花植株没有表现出RSB性状，只有在晚花背景下RSB性状才出现分离.我们推测qRSBZu-2和qRSBZu-3的候选基因就是FRI和FLC基因，并对其ORF测序，发现qRSBZu-2和qRSBZu-3在Zu-0和Col-0之间确实存在着突变.

qRSBZu-4也包含了与分枝形成相关基因CUC2[38]，对Zu-0CUC2的ORF测序，并没有在其外显子中找到有义突变，因此我们推测在qRSBZu-4中CUC2启动子区域发生了突变或者还有其他基因引起了RSB性状.

图5 QTL的等位基因效应验证Fig.5 The validation for the allele effect of QTL(a) 构建zb52 HIF群体验证qRSBZu-1;(b) 构建zb67 HIF群体验证qRSBZu-4.每个表型所统计株数均≥15株，使用Duncan test统计分析，P<0.05.

我们选择了感兴趣的qRSBZu-1和qRSBZu-4进行验证.在F4群体中找到了zb52(qRSBZu-1杂合，其他QTL区纯合)和zb67(qRSBZu-4杂合，其他QTL区纯合)株系，分别使它们自交，建立HIF群体，观察统计HIF各株系的RSB性状，并鉴定其基因型，目标QTL验证结果见图5.在每个群体内目标QTL区间，具有Col-0等位基因的植株表型均值与具有Zu-0等位基因的植株表型均值存在着显著差异.这一结果反映出我们定位到的QTL结果是可靠的.我们可以在此基础上对目标QTL进行精细定位和图位克隆，进一步开展RSB性状的分子遗传机理的研究.

3 讨 论

我们选取了实验室常用拟南芥生态型Col-0和主茎上没有侧枝的Zu-0作为亲本材料，构建了共有192个株系的RIL群体，但由于上位作用的存在，RSB的频率分布不呈正态分布，故使用BSA法实现了对RSB的QTL定位，共定位到RSB相关性状QTL4个，分别是qRSBZu-1、qRSBZu-2、qRSBZu-3、qRSBZu-4.

qRSBZu-1和2012年Huang等定位到的同样与RSB表型相关的QTL——RSB1[34]重叠，qRSBZu-2和FRIGIDA(FRI)[35]重叠，qRSBZu-3和FLC[36-37]重叠，间接证明了我们QTL定位结果是可信的、真实的.同时，我们构建HIF群体，对qRSBZu-1和qRSBZu-4进行等位基因效应验证，验证结果进一步提高了我们的QTL定位结果的可信度.本研究的结果在拟合了先前研究结果的基础上有新的发现，说明本研究选取的亲本材料在控制RSB相关性状上具有更多、更复杂的遗传多样性，从而能得到更多的遗传信息.

我们对qRSBZu-1中的Zu-0AGL6测序，其外显子没有找到有义突变，并且相较于Col-0，Zu-0的AGL6在生殖生长发育不同时期表达量没有显著性差异；另外Zu-0的qRSBZu-1相对Col-0呈隐性，而C24中AGL6相对Col-0呈显性[34].因此我们有理由相信在qRSBZu-1中还存在着其他基因参与了RSB性状的调控.

qRSBZu-4中包含了已经被报道的调控分枝发育的CUC2基因[38].然而在cuc-2突变体中，表型是主茎的节点显著性减少，在主茎和莲座的叶腋处形成额外的腋芽[12]，这无法完全解释Zu-0主茎处的叶腋无法形成并且节点没有明显减少的表型.且对Zu-0的CUC2的ORF测序，在外显子区域没有找到有义突变.我们将测定Zu-0中CUC2在生殖生长发育不同时期的表达量，以此排除CUC2作为qRSBZu-4的候选基因的可能性.

下一步的研究主要集中在对qRSBZu-1和qRSBZu-4的精细定位，用分子遗传学手段对qRSBZu-1和qRSBZu-4进行克隆和鉴定.进一步综合运用生理生化，分子生物和组学等现代生物技术手段对qRSBZu-1和qRSBZu-4在植物分枝调控中的作用机理进行全面深入的研究，以期丰富植物调控分枝的特异性分子网络，为农业生产分子育种提供理论依据.