多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜细胞凋亡及VEGF-A的表达

王立群， 周月希, 张娟

(1.中国人民解放军中部战区总医院 妇产科生殖中心， 湖北 武汉 430070； 2.湖北中医药大学 第一临床学院， 湖北 武汉 430070)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女中最常见的内分泌疾病之一，也是造成女性无排卵性不孕的主要原因，虽然药物治疗可恢复PCOS患者的排卵功能，但患有PCOS的女性发生早期妊娠流产的概率是正常妇女的4倍[1]，且PCOS患者相关子宫内膜癌的发病率是其他女性的3倍[2]，提示PCOS患者子宫内膜功能存在失常.PCOS患者内分泌代谢失常的主要表现有高雄激素、胰岛素抵抗等，对子宫内膜造成了复杂影响，导致子宫内膜功能失常的机制尚未被完全阐明.

自1976年Hopwood[3]发现人的子宫内膜存在细胞凋亡小体以来，越来越多的研究表明子宫的许多病理变化都与细胞凋亡密切相关，但是关于PCOS子宫内膜细胞凋亡尚未清楚.丰富表达于子宫内膜的血管内皮生长因子(vascular enthedolial growth factor，VEGF)，是一种多功能细胞因子，具有促进细胞分裂增殖、促进血管生成的作用，与胚胎着床以及肿瘤的发生发展密切相关[4].本研究通过观察PCOS大鼠子宫内膜的凋亡情况以及VEGF-A的表达变化，探讨细胞凋亡以及VEGF-A在PCOS子宫内膜发生功能失常的过程中可能起到的作用.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用21日龄雌性SPF级SD大鼠20只，体质量50～60 g，由湖北省实验动物研究中心[SCXX(鄂)2015-0018]提供,在湖北省疾病预防控制中心屏障环境[SYXK(鄂)2017-0065]中饲养,温度控制在(22±2)℃，相对湿度为50%～60%，自由饮食，光照周期为日夜各12 h.

1.1.2 主要试剂与仪器

硫酸普拉睾酮钠购自青岛捷世康生物科技有限公司；注射用水购自浙江瑞新药厂；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司；抗荧光淬灭封片剂购自Southernbiotech公司；DR5、DcR2兔多克隆抗体购自Abcam公司；内参兔抗β-actin抗体购自Proteintech公司.小鼠IgG-免疫组化试剂盒与HRP标记羊抗鼠二抗购自博士德生物工程有限公司；DAB试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司；RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒与DAPI购自中国碧云天公司；PVDF膜购自美国Millipore公司.

YD6L生物组织包埋机为金华市益迪医疗设备有限公司产品；RM2016轮转型切片机为上海徕卡仪器有限公司产品；BX51奥林巴斯荧光显微镜为日本OLYMPUS公司产品；DYY-7C电泳仪、垂直与转移电槽为北京六一仪器厂产品；RT-6500酶标分析仪为深圳雷杜公司产品；DB3000凝胶图像分析仪为中国天能公司产品.

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

按文献[5-6]，21日龄雌性SD大鼠，断乳，适应性喂养2 d，23日龄时随机分为两组，每组10只.其中一组为实验组，大鼠每日给予质量分数为90 mg/g按硫酸普拉睾酮钠皮下注射，相当于脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)质量分数为60 mg/g用0.4 mL注射用水溶解，连续注射20 d，建立PCOS大鼠模型，该组设为PCOS组；另一组设为对照组，每日皮下注射0.4 mL注射用水，连续注射20 d.所有大鼠注射后第21日晨用体积分数为4%水合氯醛麻醉，解剖取卵巢、子宫，分离表面多余组织，体积分数为4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，备用.

1.2.2 HE染色

将制备好的4 μm厚子宫石蜡切片分别脱蜡至水，苏木素染色1.5 min，流水冲洗返蓝，显微镜下观察核蓝紫色，体积分数为100%乙醇浸泡3 min，伊红染色10 s，体积分数为100%乙醇浸泡10 s，观察细胞质红色，晾干，中性树脂封片后，用倒置显微镜观察子宫形态变化.

1.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡

取大鼠子宫石蜡切片脱蜡至水，滴加质量浓度为20 μg/mL的蛋白酶K工作液，20 ℃～37 ℃反应15～30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；加入100 μL DNaseⅠ在15 ℃～25 ℃孵育10 min，吸水纸擦干玻片后加50 μL TUNEL反应混合液(50 μL TdT+450 μL 荧光素标记的dUTP液混匀)于标本上，37℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min 4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像，细胞核经DAPI染色后显示蓝色荧光，发生凋亡的细胞经TUNEL反应混合液染色后显示红色荧光.各组每张切片随机选取5个400倍高倍视野，统计每个视野的所有细胞数和凋亡细胞数并计算凋亡率.

1.2.4 免疫组织化学染色检测VEGF-A蛋白的表达

采用免疫组织化学技术SABC即链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法：大鼠子宫石蜡切片，分别脱蜡至水，体积分数为3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，微波抗原修复，山羊血清封闭，用PBS按1∶200稀释VEGF-A小鼠单克隆一抗抗体4 ℃过夜，生物素标记山羊抗小鼠IgG二抗，用PBS按1∶150稀释，37 ℃孵育35 min；用PBS按1∶150稀释SABC，37 ℃孵育30 min，DAB显色，显微镜下控制显色时间5～10 min，自来水洗后苏木素复染，晾干，中性树胶封片.采用日本奥林巴斯BX51荧光显微镜成像，400倍高倍视野下，观察子宫中VEFA-A蛋白的表达，阳性细胞被染成棕黄色，由Image-Pro Plus计算细胞内棕黄色区域面积(Area)及光密度值(IA)，平均光密度值(A)为两者之比(IA/Area)，棕黄色着色越深，对应的A值越大，蛋白表达越强，反之则反.

1.2.5 Western blot检测VEGF-A蛋白的表达水平

取大鼠子宫组织，加入组织裂解液，碾磨匀浆，离心取上清，应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，以6 μL样品每泳道行质量浓度为8% SDS-PAGE凝胶电泳约90 min，根据目的蛋白分子量切胶，然后将蛋白电转移至PVDF膜上，质量分数为5%脱脂奶粉溶液室温下封闭1 h，相应分子量范围PVDF膜分别加入VEGF-A(1∶200)和β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，二抗孵育2 h，ECL发光液显色，以β-actin为内参，用ImageJ图像分析软件分析目标条带光密度值，计算目标条带与内参条带吸光度的比值，即蛋白的相对含量.

1.3 统计方法

2 结果

2.1 子宫光镜HE染色观察

PCOS组大鼠子宫内膜腺体数目与对照组相比明显减少，腺体多为单个分散排列，腺腔比较小，少有迂曲，而对照组大鼠子宫内膜腺体数目较多，腺体多呈簇状排列，腺腔较大，迂曲较多(图1).

A：PCOS组大鼠子宫内膜，腺体多为单个分散排列，腺腔较小.B：对照组大鼠子宫内膜，腺体多呈簇状排列，腺腔较大.

A: The endometrium of rats in PCOS group, the glands are mostly arranged in a single dispersion, and the glandular cavity is small. B: The endometrium of rats in control group, the glands are mostly clustered, and the glandular cavity is larger.

图1 PCOS组与对照组大鼠子宫内膜(HE染色，×200)

Fig.1 The endometrium in rats with PCOS group and control group (HE staining, ×200)

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡发生率

TUNEL染色结果显示，PCOS组大鼠子宫内膜腺上皮细胞凋亡数明显减少，经统计学分析，两组大鼠子宫内膜细胞凋亡率有统计学差异(P<0.05，表1、图2).

2.3 免疫组织化学染色观察VEGF-A的表达

VEGF-A的阳性表达主要表现为细胞质和细胞膜的棕黄色染色，在两组大鼠子宫内膜中均有表达，且主要表达于子宫内膜腺上皮细胞，经统计分析，VEGF-A在PCOS组大鼠子宫内膜的表达较对照组明显减少(P<0.05，表1、图3).

表1 各组大鼠子宫内膜细胞凋亡率以及VEGF-A的表达

组别凋亡率/%VEGF-A对照组5.878±0.688 50.148 3±0.006 3PCOS组2.096±0.581 41)0.106 8±0.009 11)

1)与对照组子宫相比，P<0.05.

A，B，C：PCOS组；D，E，F：对照组.PCOS组大鼠子宫内膜腺上皮细胞凋亡数与对照组相比明显减少.

A, C, E: PCOS group; B, D, F: control group. The number of apoptosis of endometrial glandular epithelial cells in the PCOS group was significantly reduced compared with the control group.

图2 荧光显微镜观察各组大鼠子宫内膜细胞凋亡情况(TUNEL法，×400)

Fig.2 The apoptosis of endometrial cells in each group was observed by fluorescence microscope.(TUNEL method，×400)

A：PCOS组；B：对照组. PCOS组大鼠子宫内膜VEGF-A的表达与对照组相比明显减少.

A: PCOS group; B: Control group. The expression of VEGF-A in the endometrium of rats in the PCOS group was significantly reduced compared with the control group.

图3 VEGF-A在各组大鼠子宫内膜中的表达(SABC法，×400)

Fig.3 Expression of VEGF-A in the endometrium of rats in each group(SABC method，×400)

2.4 Western blot检测VEGF-A蛋白的表达水平

Western blot结果表明，PCOS组大鼠子宫中VEGF-A蛋白表达较对照组减少，经统计分析，两组蛋白表达相比有统计学差异(P<0.05，图4).

1)与对照组相比P<0.05

Fig.4 Expression levels of VEGF-A protein in the uterus of rats in each group

3 讨论

PCOS是育龄期妇女最常见的内分泌代谢性疾病，主要临床表现为持续无排卵、高雄激素血症、糖代谢异常、胰岛素抵抗等.Haoula等[2]研究表明PCOS患者发生子宫内膜增生的概率为5%～10%，发生子宫内膜癌的风险是健康人群的3倍.PCOS患者持续无排卵会使子宫内膜长期受雌激素刺激而无孕酮拮抗，子宫内膜细胞有丝分裂活跃性及细胞突变率增加，此外雌激素还可刺激子宫内膜雌激素受体的表达增多，使子宫内膜对雌激素的反应增高[7]，进一步导致内膜增生.雄激素既可与雄激素受体结合抑制DNA的合成进而抑制细胞生长，又可促进芳香化酶mRNA的合成进而可转化为雌二醇，间接促进子宫内膜增殖[8]，有研究表明，PCOS患者增生的子宫内膜中芳香化酶P450 mRNA表达增加[9]，提示高雄激素在PCOS内分泌的环境中可能更倾向于转化为雌激素促进内膜增殖.糖代谢异常和胰岛素抵抗普遍存在于非典型子宫内膜增生和子宫内膜癌患者中[10]，近年来胰岛素抵抗在PCOS患者子宫内膜增生病变中所起到的作用已得到共识[11]，作为一种重要的生长调节因子，胰岛素不仅能调节糖代谢，还可以促进细胞增殖及抑制细胞凋亡，因而具有促进子宫内膜增殖的作用，此外，胰岛素抵抗和糖代谢紊乱，可能通过降低性激素结合蛋白水平[12]而增加了血清游离雌激素的水平，进而加强促进子宫内膜增生的作用.由此可见，PCOS内分泌代谢失常对子宫内膜造成了极其复杂的影响，目前PCOS子宫内膜功能失常的机制尚未完全明了.

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性的程序死亡，是多细胞生物正常发育和保持稳态的一个至关重要的过程.在正常的子宫内膜中，细胞凋亡多见于分泌晚期和月经期，在增生期和分泌初期开始时很少检测到细胞凋亡，细胞凋亡通过清除子宫内膜功能层的衰老细胞来维持内膜组织正常结构和功能[13].子宫内膜的病理性改变常会伴有细胞凋亡的异常改变，研究表明，子宫内膜癌早期患者的子宫内膜细胞凋亡调控表现异常[14]，子宫内膜异位症患者的子宫内膜细胞具有更高的增殖活性，其凋亡水平较正常人明显降低[15].本研究首先构建PCOS大鼠模型，采用TUNEL法检测各组大鼠子宫内膜细胞凋亡情况，结果显示PCOS组大鼠子宫内膜腺上皮细胞的凋亡率显著降低，由于细胞凋亡减少可能导致PCOS子宫内膜中衰老细胞以及癌变细胞不能及时清除，从而使子宫内膜发生增厚甚至癌变，故推测子宫内膜细胞凋亡减少可能也是PCOS患者容易发生子宫内膜癌的原因之一.PCOS子宫内膜细胞凋亡减少考虑跟雌激素长期刺激子宫内膜细胞有丝分裂及高胰岛素水平促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等密切相关.

VEGF是一种对血管内皮细胞具有特异促有丝分裂作用的糖蛋白，与相应受体结合后具有促进血管生成和维持血管通透性的作用，是调节血管生成的重要因子.目前已知的VEGF家族成员包括VEGF-A、B、C、D、F以及胎盘生长因子6种，其中VEGF-A常简称为VEGF，VEGF在子宫内膜中呈周期性表达，受卵巢分泌的雌孕激素调节[4]，是子宫内膜分泌的主要血管生成因子，而正常女性子宫内膜呈周期性变化，与子宫血管的生成与退化密切相关[16]，故VEGF在维持女性子宫正常生殖功能的过程中起到重要作用.本研究显示，VEGF-A在PCOS组大鼠子宫内膜的表达较对照组明显降低，由于VEGF-A可促进血管内皮细胞增殖使子宫内膜变厚，推测PCOS大鼠子宫内膜VEGF-A表达减少可能是子宫内膜增生过度的一种代偿性作用.Gordon等[17]研究表明上皮膜蛋白-2(epithelial membrane protein-2，EMP2)可通过上调VEGF的表达来调节子宫内膜癌细胞的血管生成，进而促进肿瘤细胞的形成，而应用的EMP-2 IgG-1治疗减少VEGF的表达后，肿瘤负荷显著降低，子宫内膜癌患者生存率显著提高，提示VEGF促血管生成的作用还参与子宫内膜癌的发展，而PCOS患者发生子宫内膜癌的风险较高，那么PCOS子宫内膜中VEGF-A的表达下调是否在PCOS发展成为子宫内膜癌的过程中起到一定的抵抗作用，有待于进一步的研究.

综上，PCOS子宫内膜功能失常可能与子宫内膜细胞凋亡减少有关，细胞凋亡减少导致子宫内膜中的衰老细胞和癌变细胞无法得到及时清除，子宫内膜发生增生甚至癌变，而VEGF-A的表达下调可能是PCOS子宫内膜增生过度产生的一种代偿性作用，通过减少血管内皮细胞增殖，减轻子宫内膜增生程度，延缓PCOS患者发生子宫内膜癌的进程.