血管生成相关因子在口腔白斑癌变过程中的表达及意义

王亚敏 孟文霞 周震 韩倩倩 资云玲

南方医科大学口腔医院（广州510280）

口腔黏膜白斑（oral leukoplakia）是公认的口腔癌的癌前病变，病变率约为4%～40%，口腔白斑伴有上皮异常增生时，恶变潜能随上皮异常增生程度的增加而增大。白斑癌变是一个连续动态过程，经历了由正常黏膜到单纯增生、异常增生再到原位癌、浸润癌的演变［1］。白斑异常增生程度直接决定了其癌变潜能［2］。所以深入了解口腔白斑癌变的发病机制及白斑的早期治疗十分重要。肿瘤的发生和发展与肿瘤组织中微血管生成密切相关。血管生成被认为是连接慢性炎症和肿瘤之间的桥梁，过度的血管生成同时也是多种慢性炎症和肿瘤进一步发展的标志［3-5］。新生血管为恶性肿瘤持续恶性生长提供必要的氧和其他营养物质；同时被恶性肿瘤用来排除代谢物质，成为播散和转移的最直接通道。因此，抑制血管的生长、控制血行转移和淋巴转移就能使得肿瘤的发生发展得到有效控制，从而得到有效的干预［4］。

细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecular，ICAM-1）和血管细胞间黏附分子-1（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，均为调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质间结合、起黏附作用的一类膜表面糖蛋白。ICAM-1 和VCAM-1 在介导细胞免疫机制、炎性疾病及肿瘤等多种生理、病理过程中均有重要作用［5-6］。近年国内外研究发现，ICAM-1 可能参与了糖尿病肾病的发生与发展［9］；sVCAM-1/sICAM-1 比率可作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物［7］；内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化的早期指标，其特征是过度表达黏附分子包括ICAM-1 和VCAM-1［8］；血清sICAM-1 的浓度可作为判断鼻咽癌发生程度及疗效评价的指标；大肠癌细胞上ICAM-1 的过度表达与淋巴结转移密切相关；ICAM-1 表达增加促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭和转移［9］等。研究多集中在炎症及癌组织方面，那么ICAM-1 和VCAM-1 在癌前病变中是否存在表达，在口腔黏膜白斑癌变过程中是否存在表达变化目前尚无相关研究报道。本研究旨在通过检测ICAM-1 和VCAM-1 在正常口腔黏膜、白斑伴轻-中度异常增生、白斑癌变组织中的表达，探讨ICAM-1 和VCAM-1 对口腔白斑癌变的影响，为口腔白斑癌变的早期诊断和靶向治疗提供新途径。

1 资料与方法

1.1 标本收集 收集我院病理科2018年以前存放的口腔白斑伴轻-中度异常增生组织10 例、口腔白斑癌变组织10 例，均排除患有其他口腔黏膜疾病、系统性疾病及近3 个月内使用过免疫制剂者。所有样本均经病理学诊断确诊，符合口腔白斑伴轻-中度异常增生（1972年WHO 关于上皮异常增生12 项标准）及口腔鳞状细胞癌（UICC，2002版）的病理学特点。收集我院正颌外科患者术后多余的正常口腔黏膜标本15 例，行石蜡包埋，作为对照组。

1.2 主要试剂 ICAM-1 鼠抗人单克隆抗体（1∶3 000；Abcam，美国）和VCAM-1 鼠抗人单克隆抗体（1∶200；Abcam，美国）。免疫组化染色试剂盒（DakoCytomation EnVision system）。

1.3 免疫组织化学染色 石蜡标本连续切片后置于二甲苯2 次，再依次置于体积分数100%、95%、80%、70%酒精溶液脱蜡至水。然后将切片置于EDTA 抗原修复缓冲液（pH 9.0）中进行抗原修复，再将切片置于质量分数3%过氧化氢溶液中室温避光孵育25 min 后，用PBS 洗涤3 次后血清封闭。小心甩去封闭液，滴加按一定比例配好的一抗置于湿盒内4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液洗涤3 次，加生物素化二抗37 ℃孵育50 min。磷酸盐缓冲液洗涤3 次，DAB 显色，镜下观察，适时终止；苏木素复染30 s，自来水冲洗15 min；氨水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，加拿大树胶封片。所有标本均在同一条件下染色。

1.4 免疫组化染色结果判定 ICAM-1 和VCAM-1阳性表达判断：ICAM-1 和VCAM-1 阳性染色为棕黄色颗粒或棕色颗粒。两人双盲法观察切片。每例切片选取10 个高倍镜（400 倍）视野下计算细胞总数和阳性细胞个数，计算ICAM-1（+）和VCAM-1（+）细胞表达百分率（%）。

1.5 统计学方法 本研究中连续型变量和分类变量分别以均数±标准差和频数（百分比）表示。采用SPSS 17.0 统计软件，组间变量采用t检验，在显著性水平5%的标准下，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ICAM-1 和VCAM-1 在正常口腔黏膜、口腔白斑伴轻-中度上皮增生及口腔白斑癌变组织的表达 在15 例正常对照组中，ICAM-1 和VCAM-1全部呈阴性表达，观察不到棕黄色颗粒沉积。在10 例白斑轻-中度异常增生组及10 例白斑癌变组均有阳性着色，ICAM-1 表达集中在基底膜下方区域，ICAM-1 和VCAM-1 在间质中内皮细胞和炎细胞胞浆中阳性表达。见图1、2。

2.2 ICAM-1 和VCAM-1 在正常口腔黏膜、口腔白斑伴轻-中度异常增生及口腔白斑癌变的3 组表达对比情况 ICAM-1 和VCAM-1 的阳性细胞百分率各组间相互比较，组间差异均具有显著意义（P＜0.05，表1、2）。口腔白斑癌变组高于口腔白斑伴轻中度异常增生组高于正常黏膜组。

表1 各组ICAM-1 阳性细胞百分率统计表Tab.1 Descriptive statistics for ICAM-1expression in all groups

图1 ICAM-1 在口腔正常黏膜、白斑伴轻-中度异常增生、白斑癌变组中的表达（免疫组化）Fig.1 The expression of ICAM-1 in nomal，oral leukoplakia with mild to moderate epithelial dysplasia and oral leukoplakia canceration tissues（IHC）

图2 VCAM-1 在口腔正常黏膜、白斑伴轻-中度异常增生、白斑癌变组中的表达（免疫组化）Fig.2 The expression of VCAM-1 in nomal，oral leukoplakia with mild to moderate epithelial dysplasia and oral leukoplakia canceration tissues（IHC）

3 讨论

本研究结果显示，ICAM-1 和VCAM-1 在正常黏膜组织中呈阴性表达。两种黏附分子均表达于内皮细胞和淋巴细胞中，正常组织中不表达或低水平表达。免疫组化结果显示ICAM-1 和VCAM-1在口腔白斑伴轻-中度异常增生及白斑癌变组织的间质中阳性表达，并且随着白斑癌变过程表达呈升高趋势；ICAM-1 集中表达在基底膜下方区域，VCAM-1 在间质中可见，该两种黏附分子阳性表达区域均可见大量炎性细胞。由于ICAM-1 的主要受体为淋巴细胞相关抗原-1（lymphocyte associated antigen-1，LFA-1），表达在淋巴细胞和除红细胞以外的所有造血细胞；VCAM-1 的主要受体为缓慢抗原-4（very late antigen-4，VLA-4），选择性地促进单个核白细胞的黏附。研究［10］认为ICAM-1和LFA-1 结合反应对于淋巴细胞黏附并迁移至炎症区域起重要作用；血清sICAM-1 与LFA-1 的结合可以制约循环细胞毒性T 淋巴细胞，帮助肿瘤细胞逃过自身免疫识别从而更易发生侵袭和转移。sICAM-1 对血管再生和刺激肿瘤细胞生长也起重要作用［5］。研究结果提示ICAM-1 和VCAM-1 可能与炎性细胞共同参与了白斑癌变的过程；该两种黏附分子随着癌变过程表达升高，在一定程度上可以反映癌前病变的可能性。

此外，ICAM-1 和VCAM-1 可作为新生血管形成的生理性指标［8］，并对调节白细胞跨血管内皮运动和炎症反应起重要作用［10-11］。研究［12］显示在白斑癌变过程中组织的微血管密度逐渐增高，血管内皮因子VEGF 的表达随着白斑异常增生到癌变过程中呈升高趋势，这与该两种黏附分子表达趋势一致。正常细胞进展成新生瘤状态需要以下条件：获得生长信号、抗生长信号的不敏感；抵抗细胞死亡且具有无限复制能力；持续的血管生成、组织浸润转移；促进肿瘤的炎症反应、基因组不稳定和突变能力［18］。结合本实验结果，在白斑异常增生、癌变的过程中，ICAM-1 和VCAM-1 的升高不仅促进局部的炎症反应，同时促进血管生成，微血管密度增加，促进了癌变的进程；随着表达增加，淋巴细胞与其黏附，肿瘤细胞凭借黏附的淋巴细胞黏附到血管上皮上并渗出血管外，播散到其他部位，逃避机体的免疫监视生长浸润。所以ICAM-1 和VCAM-1 参与肿瘤的发生、发展及转移多个过程。

综上所述，ICAM-1 和VCAM-1 在口腔白斑癌变过程中起了重要作用。随着抗血管生成疗法逐渐成为肿瘤治疗的新策略，临床上检测ICAM-1 和VCAM-1 有望作为口腔白斑是否发生癌变的指标；同时该抗体在口腔白斑治疗中具有潜在应用前景。