神经鞘磷脂合成酶2 基因沉默对乳腺癌细胞凋亡的影响

杭月 林昌岫 黄成日

延边大学附属医院1妇产科，2中心实验室（吉林延吉133000）

神经鞘磷脂（sphingomyelin，SM）是脂质筏的重要成分［1］，有希望成为肿瘤诊断和治疗的新靶标。神经鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）是SM 合成的最后一个酶，包含SMS1 和SMS2两个同工酶。SMS1 参与SM 的生物合成，而SMS2与SM 合成后的加工修饰有关，是影响细胞内SM、神经酰胺（ceramide，Cer）等细胞因子活性和浓度的关键酶，同时也是炎症反应中重要的调控因子［2］。由于有研究证实，SMS1 缺失后对癌细胞的影响作用并不明显，所以选择性的SMS1 抑制剂并不能作为理想的细胞毒性药物用于临床［3］。而下调SMS2 的表达可影响脂质筏的功能，进而抑制细胞的凋亡［4］。另外，已知肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）可通过激活酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）降解SM 而生成Cer，诱导细胞凋亡［5］。为进一步证明SMS2 与肿瘤细胞亡的关系，笔者拟以人乳腺癌细胞株MCF-7 为实验模型，用TNF-α诱导凋亡后，将SMS2 siRNA 转染至细胞中，探讨SMS2 基因沉默后对MCF-7 细胞凋亡的影响，从而为临床治疗和药物研发提供潜在的靶标。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7 由延边大学病理学教研室提供并传代保存。将MCF-7 细胞培养在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素双抗的RPMI1640 培养液中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中进行传代培养。

1.2 MTT 法检测细胞增殖 将对数期生长的MCF-7 细胞（1×104/孔）单层接种至96 孔板中，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养，加入不同梯度浓度的TNF-α（50、100、200、400、800 ng/mL），孵育48 h 后，每孔加入20 μL MTT，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中孵育4 h 后，弃除上清液，每孔加入200 μL DMSO，置于振荡器上震荡5 min，置于显微镜下观察无紫色结晶物。将96 孔板放置于酶标仪上，检测波长为570 nm 处的光密度值（OD值），计算细胞增殖抑制率和IC50：增殖抑制率（%）=1-OD值（受试孔）/OD值（对照空）×100%，每组取8 个复孔平均值。

重复上述实验，取IC50浓度的TNF-α分别作用于细胞24、48、72、96 h，检测波长为570 nm 处的光密度值（OD值），计算细胞增殖抑制率。

1.3 构建SMS2 siRNA转染细胞株 用DEPC水稀释SMS2 siRNA 至终浓度为20 μmol/L。取适量的SMS2 siRNA 加入至Opti-MEM 转染培养基中，轻轻混匀。再取适量的LipofectamineTM2000 与之混合，室温下孵育约20 min，形成siRNA-LipofectamineTM2000 复合体。于荧光倒置显微镜下观察荧光染色判断感染率。提前1 d 在相应备行转染的6 孔板上接种5 × 105个细胞，加入不含FBS 和双抗的培养基400 mL 至培养箱中饥饿培养3 h，随后加入10%FBS 和TNF-α（终浓度IC50）培养24 h 后，待融合率达到50%～60%时，再加入适量脂质体复合体，使SMS2 siRNA 终浓度为100 nmol/L。置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h。提取细胞RNA 及蛋白，验证目的基因表达情况及转染效率。实验分为4 组：空白对照组（CTL 组）、TNF-α组、阴性对照组（SiR-Con 组）和转染组（SiR2 组）。

1.4 酶活性检测 收集对数期生长的MCF-7 细胞（1 × 107个），加入匀浆液置于冰浴中，取出匀浆粗酶液100 μL 加入SMS 反应体系（取100 μL 粗酶液、60 mL 匀浆液、425 μL 双蒸水、3 μL PC、2 μL NBD-Cer，37 ℃反应5 h）中，37 ℃反应5 h，加入900 μL 氯仿-甲醇（2∶1）溶液，充分震荡混匀后，离心并提取有机相，氮气干燥，用薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）测定SMS 酶活性。

1.5 Hoechst33258/PI 双染法观察活细胞状态将各组细胞（1 × 104个/孔）单层接种至24 孔板中正常培养，每组设置8 个平行孔，加入预冷的PBS洗涤3 次，每孔加入浓度为5 μg/mL 的Hoechst 33258 染液200 μL，37 ℃避光孵育15 min，随后每孔加入浓度为15 μg/mL 的PI 染液50 μL，4℃避光孵育15 min，采用高内涵活细胞成像系统观察细胞凋亡形态。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，采用预冷的PBS 洗涤3 次后，3 000 r/min 离心5 min，离心半径10 cm，弃上清；加入500 μL Binding Buffer重悬，加入Annexin V 5 μL，避光孵育15 min；加入PI 5 μL，4 ℃避光孵育15 min；3 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，弃上清；加入300 μL 结合缓冲液；上机检测。所有操作严格按照试剂盒说明书操作进行。采用流式细胞仪（Ex=488 nm，Em=530 nm）检测细胞凋亡情况。

1.7 荧光定量实时PCR （1）采用Trizol 法提取细胞总RNA；按照RNA 提取试剂盒说明书提供的步骤进行操作，采用分光光度计检测RNA 浓度。（2）以细胞cDNA 为模板，以β-actin 作为内参。将10 μL 反应体系置于37 ℃恒温水浴20 min，85 ℃5 s，将反应生成的cDNA 放于-20 ℃保存备用。（3）冰浴中配制20 μL PCR 反应体系，95 ℃30 s 预变性，95 ℃5 s 退火，60 ℃20 s 延伸，循环40 次，95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s 终末延伸，4 ℃保存。引物序列如下：鼠抗B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（F：5′- CATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3′；R：5′-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3′）；鼠抗Bcl-2 相关X 蛋白（bcl-2-associated X protein，Bax）（F：5′-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′；R：5′-CAGCCTTGAGCACCAGTTTG-3′）；caspase-3（F：5′-CTGGGAAGGGTTGTGAATGA-3′；R：5′-CAGTTTGGCTTGCTGGTCTC-3′）。根据使用说明调整基线，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相对表达量。

1.8 免疫印迹法（Western Blot） 收集对数期生长的MCF-7 细胞1 × 107个，加入预冷PBS，清洗3 次；加入RIPA 细胞裂解液，收集上清；测定蛋白浓度。加入SDS 上样缓冲液充分混匀，置于95 ℃水浴中10 min，使蛋白变性。将10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离蛋白转移方法转移到PVDF 膜上并浸入密封液中1 h。冲洗，分别加入Bcl-2 抗体（1∶500 稀释）、Bax 抗体（1∶500 稀释）、caspase-3 抗体（1∶1 000 稀释），置于4 ℃摇床上过夜。采用TBST 冲洗3 次，加入二抗（1∶5 000 稀释），37 ℃孵育1 h，洗膜，显影5 min，采用Alpha 凝胶成像分析系统分析凝胶光密度值。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行处理；组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α 对MCF-7 细胞增殖活性的影响 经MTT 法检测，不同浓度TNF-α 对MCF-7 细胞增殖的抑制率分别为（9.86±1.38）%、（15.41±3.77）%、（36.28±7.15）%、（58.34±6.86）%、（64.78±7.45）%，IC50为205.7 ng/mL（图1）。

图1 经MTT 法检测TNF-α 对MCF-7 细胞增殖活性的影响Fig.1 Proliferation of MCF-7 cells induced by TNF-α by MTT assay

2.2 Si-SMS2 慢病毒转染效果 慢病毒按感染复数（multiplicity of infection，MOI；MOI=病毒数量/细胞数量）为50 时转染效率较高，细胞状态良好。经qRT-PCR 法检测，SiR2 组细胞SMS2 mRNA 表达水平明显低于CTL 组和SiR-Con 组，差异有统计学意义（F= 49.75，P＜0.000），基因表达水平分别下降62.5%和64%（图2）。

2.3 SMS 酶活性测定 经凝胶图像分析仪扫描，CTL 组、TNF-α组、SiR-Con 组、SiR2 组SMS 酶活性灰度值分别为（18.17±3.78）、（12.26±3.15）、（11.53±3.65）、（4.35±1.29），经TNF-α诱导后，TNF-α组、SiR-Con组以及SiR2组细胞SMS酶活性灰度值均低于CTL 组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且与TNF-α组、SiR-Con 组相比，SiR2 组细胞SMS 酶活性明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 MCF-7 细胞转染SMS2 siRNA 后SMS2 mRNA 表达情况Fig.2 SMS mRNA levels of MCF-7 cells transfected with SMS2 siRNA

图3 基因沉默后SMS 酶活性比较Fig.3 Changes of SMS activity after RNA interference

2.4 MCF-7 细胞凋亡情况

2.4.1 经Hoechst33258/PI 双染法观察各组活细胞状态 如图4A 所示，活细胞为蓝色，而坏死细胞核呈红色并肿大，凋亡细胞可见细胞核染色质凝聚、皱缩、致密的红色或亮蓝色。CTL 组可见正常细胞的有丝分裂，而TNF-α组、SiR-Con 组和SiR2组细胞出现明显的凋亡和坏死，尤其是SiR2 组细胞红色标记细胞明显多于其他3组。CTL组、TNF-α组、SiR-Con 组、SiR2 组细胞凋亡率分别为（3.11 ±0.69）%、（14.29 ± 2.71）%、（13.85 ± 1.96）%、（31.08± 5.46）%，细胞坏死率分别为（0.63 ± 0.12）%、（1.72 ± 0.38）%、（1.65 ± 0.40）%、（3.75 ± 0.47）%，经TNF-α诱导后，TNF-α组、SiR-Con 组以及SiR2 组细胞凋亡率和坏死率均高于CTL 组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且与TNF-α组、SiR-Con组相比，SiR2 组细胞凋亡率和坏死率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05，图4B、4C）。

图4 Hoechst33258/PI 双染法观察各组细胞凋亡率和坏死率Fig.4 Apoptosis and death rates of MCF-7 cells observed by Hoechst33258/PI staining

2.4.2 FITC-annexin V/PI 双染法观察各组细胞凋亡情况 经FCM 法检测（图5A），CTL 组、TNF-α组、SiR-Con 组、SiR2 组细胞凋亡率分别为（7.15 ±2.14）%、（21.46 ± 5.72）%、（23.05 ± 7.28）%、（39.57±7.35）%，经TNF-α诱导的3组细胞，TNF-α组、SiRCon 组以及SiR2 组细胞凋亡率均高于CTL 组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且与TNF-α组、SiR-Con 组相比，SiR2 组细胞凋亡率进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5B。

2.5 SMS2 基因沉默对MCF-7 细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响

2.5.1 qRT-PCR 法检测 如图6A 所示，经TNF-α诱导后，TNF-α组、SiR-Con组以及SiR2组细胞Bcl-2基因表达量明显低于CTL 组，而Bax 和caspase-3基因表达量均高于CTL 组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；而且与TNF-α组、SiR-Con 组相比，SiR2 组细胞Bcl-2 基因表达量进一步降低，Bax 和caspase-3 基因表达则进一步上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5.2 Western Blot 检测 如图6B 所示［1］，与qRTPCR法检测结果基本一致，经TNF-α诱导后，TNF-α组、SiR-Con 组以及SiR2 组细胞Bcl-2 蛋白表达量明显低于CTL 组，而Bax 和caspase-3 蛋白表达量均高于CTL 组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；而且与TNF-α组、SiR-Con 组相比，SiR2 组细胞Bcl-2蛋白表达量进一步降低，Bax 和caspase-3 蛋白表达则进一步上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

HAMPTON 等［6］首次发现可溶性神经鞘磷脂与细胞信号转导密切相关。尤其是Cer 作为神经鞘磷脂家族最重要的成员之一，既是细胞膜的主要组成成分，也是细胞凋亡、增殖、活化等过程的重要参与者。而与催化Cer 相关的关键酶SMS 也逐渐引起众多学者的关注。近几年，有研究发现SMS 活性改变可能与细胞凋亡有关。SMS 包含SMS1 和SMS2 两种同工酶，细胞内SMS2 缺乏可以明显降低SMS 酶活性以及细胞内SM 的水平［7］。

图5 流式细胞术检测SMS2 基因沉默对MCF-7 细胞凋亡的影响Fig.5 Apoptosis of MCF-7 cells by flow cytometry

图6 SMS2 基因沉默对MCF-7 细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响Fig.6 The mRNA and protein levels of apoptosis-related factors

本研究首先通过MTT 法检测不同浓度梯度的TNF-α对MCF-7 细胞凋亡的促进作用，最终选择IC50浓度即205.7 ng/mL 作为后续研究的作用浓度。TNF-α是由活化的单核巨噬细胞分泌产生的一类最重要的细胞因子，作用机制复杂，对乳腺癌细胞呈现双向调控作用［8］。在体外可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，促使其凋亡；而在体内则可通过调控机体免疫功能以及促炎性反应等，促使肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡［9］。最新有研究证实TNF-α可通过激活酸性神经鞘磷脂降解鞘磷脂，从而生成Cer，诱导细胞发生凋亡［10］。因此本项研究旨在分析SMS2 基因沉默对TNF-α诱导MCF-7 细胞体外凋亡实验的影响。

既往报道称，SMS 基因异常表达不仅影响SMS酶活性，对细胞和培养基中SM 的水平也有一定的调节作用［11］。本研究也发现，下调SMS2 基因表达后，MCF-7 细胞内SMS 酶活性显著降低。同时出现典型的细胞凋亡特征，与空白MCF-7 细胞组或者单纯TNF-α诱导组相比，si-SMS2 组细胞凋亡率进一步增加。因此，笔者推测沉默MCF-7 细胞SMS2 基因表达后，细胞内SMS 酶活性降低，底物Cer 利用率随之下降，而剩余的Cer 水平也相应升高，Cer 作为公认的促凋亡信号分子，可能与多种信号通路调节或凋亡相关蛋白的表达有关。随后笔者进一步证实，经TNF-α诱导后，TNF-α组、SiRCon 组以及SiR2 组细胞Bcl-2 基因表达量明显低于CTL 组，而Bax 和caspase-3 基因表达量均高于CTL组细胞，并且与TNF-α组、SiR-Con组相比，SiR2组细胞Bcl-2 基因表达量进一步降低，Bax 和caspase-3基因表达则进一步上调。据判断，SMS2 作为催化卵磷脂和Cer 生成SM 和甘油二酯的关键酶，其表达下调，则底物Cer 水平相应增加，DAG 和SM水平随之减少。作为细胞内重要的第二信使，Cer和DAG 均与凋亡酶系统、线粒体凋亡途径等密切相关［12］。其中Bcl-2 蛋白家族和caspase 家族是目前最受关注的、作用最为确切的凋亡调控基因。Bcl-2 家族蛋白属于抗凋亡因子，主要通过调节细胞色素C 的释放来促进Bax 或抑制Bcl-2 诱导细胞凋亡［13］。当抗凋亡基因Bcl-2 表达上调时，Bcl-2与Bax 形成异源二聚体，从而抑制细胞凋亡。而caspase-3是多种凋亡途径共同的下游调控蛋白，被称为“死亡执行蛋白”［14］。而近年来关于Bcl-2、Bax、caspase-3 三者的关系研究也发生了突破性进展，发现Bcl-2、Bax 不仅是caspase-3 的上游调控基因，同时也是caspase-3 的直接作用底物，三者既相互联系，又相互制约［15］。因此，通过本项研究说明SMS2 基因沉默后细胞凋亡作用与死亡受体通路和线粒体途径均密切相关。

综上所述，通过体外细胞实验证实，乳腺癌细胞脂质筏中SMS2 基因缺失与促使细胞凋亡有关。SMS2 基因沉默可降低细胞内SMS 酶活性，通过抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表达，同时上调促凋亡基因Bax 和caspase-3 的表达水平，提高TNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的作用，因此及SMS2 基因表达调控可成为乳腺癌化疗药物的重要干预靶点。但是本项研究只是初步证明SMS2 基因沉默与乳腺癌细胞的凋亡存在一定的联系，如证实这个具体的作用机制，还需要纳入更多的肿瘤细胞进行进一步深入且细致地研究。