二乙基亚硝胺对肝脏过表达miR-155 转基因小鼠肝癌发生的影响

陈丽 林霞 关燕红 林晓琳 肖东 杜弢

1广州医科大学附属第二医院（广州510260）；2南方医科大学肿瘤研究所（广州510515）

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA 分子，对靶基因的表达起负向调控的作用。miRNAs 的作用机制是与RNA 诱导的沉默复合物结合后，互补结合靶mRNA 的3′-UTR 区，降解靶mRNA 或者阻止靶mRNA 转录后的翻译［1-3］。miR-155在多种人体肿瘤组织中异常表达，与肿瘤发生、发展、转移及预后等密切相关，被认为是癌性微小RNA（oncomiR）［4-6］。研究发现，miR-155 过表达促进肝细胞肝癌细胞增殖和裸鼠皮下成瘤，而下调miR-155则抑制HCC细胞增殖和裸鼠皮下成瘤［7-9］，以上研究结果表明，miR-155 可能参与肝癌的发生发展，但目前尚缺动物体内的实验证据。Cre/lox P 系统通过Cre 重组酶特异性识别lox P 位点，对DNA 片段进行删除、倒置和易位。调控Cre 基因的表达，即可在体内外调控靶基因的表达，因此Cre/lox P系统已成为一种广泛应用的基因操作工具［10-11］。为更准确模拟miR-155 在人体上起始某种肿瘤发生的过程，有必要借助基因表达调控系统（如Cre/lox P 系统）建立条件性过表达miR-155 的转基因小鼠。为此，本实验制备了携带多个报告基因（RFP 和Luc）的Rm155LG 转基因小鼠，运用Cre/lox P 系统成功建立了肝脏特异性过表达miR-155的Rm155LG/Cre 双转基因小鼠，并发现miR-155 可以促进DEN 诱导的小鼠肝癌的发生，这为揭示miR-155 在肝癌发生中的作用奠定了坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体 质粒pEμ-mmu-miR155（含318 bp 的小鼠miR-155 前体序列）由美国教授Carlo M.Croce（Ohio State University）惠赠。

1.1.2 实验动物 SPF 级性成熟C57BL/6（B6）小鼠和Alb-Cre 转基因小鼠分别购自南方医科大学实验动物中心和南京大学模式动物研究中心。实验动物饲养于南方医科大学实验动物中心SPF级屏障设施内。C57BL/6 小鼠用作以下群体：供受精卵用雌鼠和种公鼠，ICR小鼠用作以下群体：假孕母鼠和结扎雄鼠。本研究经过本单位伦理委员会的审批。

1.1.3 主要试剂 PCR 扩增试剂dNTP 和Taq 酶等、逆转录试剂盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和qRT-PCR 试剂盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）均购自TaKaRa 公司。TRIzol 试剂购自ThermoFisher Scientific 公司。DEN购自Sigma公司。β-catenin、cmyc 购自Abcam 公司，p21 购自博奥森公司，CCNG1购自proteintech 公司，GSK3β、p-GSK3β购自CST公司。

1.1.4 主要仪器 体内可见光成像系统（Xenogen IVIS Spaectrum）为美国Caliper Life Sciences 公司产品，体视荧光显微镜（Nikon，AZ100）为Biometra公司产品，PCR 仪为BIO-RAD 公司产品，荧光定量PCR 仪LightCycleII 为Roche 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 转基因片段Rm155LG制备 为制备转基因片段Rm155LG，分别用SfiⅠ和SspⅠ酶切pRm155LG质粒，胶回收9 154 kb 的转基因片段，经纯化和定量，并经过经酶切和测序鉴定正确，即可用于原核显微注射法。转基因片段Rm155LG 的结构示意图见图1。

图1 转基因片段Rm155LG 结构和组成Fig.1 Schematic diagram of Rm155LG construct used to generate Rm155LG transgenic mice

1.2.2 原核显微注射法制备Rm155LG 转基因小鼠 采用常规分子生物学方法制备转基因片段Rm155LG。本研究采用DNA 原核显微注射法制备Rm155LG 转基因小鼠，挑选注射后状态良好C57BL/6 小鼠来源的单细胞受精卵，移植进ICR 假孕母鼠输卵管内，仔鼠一般19.5～20.0 d 后出生。

1.2.3 筛选与鉴定Rm155LG 转基因小鼠 剪取出生后2 周小鼠的部分鼠耳，置于小动物活体成像仪或体视荧光显微镜下，mRFP 表达阳性的为Rm155LG 转基因小鼠。分别选取mRFP 阳性小鼠和同窝对照小鼠，提取鼠耳组织的基因组DNA 进行多聚酶链式反应（PCR），mRFP 扩增采用引物对P1/P2（P1：5′-GGGAGCGCGTGATG AAC-3′，P2：5′-CGTTGTGGGAGGTGATGTC-3′），myo（作为内参）扩增采用引物对P3/P4（P3：5′-TTACGTCCATCGTGGACAGC-3′，P4：5′-TGGGCTGGGTGTTAGCCTTA-3′）。PCR 扩增后，取5 μL 反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 运用Cre/lox P系统建立肝脏过表达miR-155的Rm155LG/Cre双转基因小鼠 将Rm155LG转基因小鼠与Alb-Cre 转基因小鼠交配，获得Rm155LG/Cre 双转基因小鼠，Cre 重组酶在双转基因小鼠体内介导DNA 重组删除转录终止盒片段后，将在肝脏特异性激活下游转基因miR-155 和Luc 表达。腹腔注射底物D-luciferin（15 mg/kg）后，通过小动物活体成像仪检测出生后几天的仔鼠的mRFP 和Luc 的表达，从而筛选出Rm155LG/Cre 双转基因小鼠。数周后，检测Luc 阳性和Luc 阴性子代小鼠活体和离体肝脏Luc 表达。

1.2.5 检测Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝脏中miR-155 转基因的表达水平 选取Rm155LG/Cre双转基因和同窝对照小鼠，提取肝脏总RNA 并进行cDNA 的合成（RT 引物序列如下：U6：AACGCTTCACGAATTTGCGT，miR-155：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCC），具体操作参见试剂盒说明书（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）。以cDNA 为模板，采用qRT-PCR的方法，分别扩增U6（引物序列：上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′）和miR-155 基因（引物序列：上游：5′-GACTGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′），对小鼠肝脏中miR-155 表达水平进行检测，具体操作参见试剂盒说明书（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）。

1.2.6 DEN 诱导小鼠肝癌模型的制备 选取出生后15 d 的Rm155LG/Cre 双转基因小鼠和同窝对照小鼠，给予腹腔注射DEN 25 mg/kg，6 个月后处死小鼠，取小鼠肝组织行大体形态学观察和Western Blot 检测。

1.2.7 Western Blot 检测肝脏组织中肝癌相关基因的表达 提取肝脏组织总蛋白，用BCA 法蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白加样10%SDS-PAGE 胶的孔槽中，电泳，然后将凝胶中的目的条带转移到PVDF 膜上，350 mA 电转移120 min，室温5%BSA 封闭1 h，加入抗β-catenin、c-Myc、p21、CCNG1、GSK3β和p-GSK3β抗体，4 ℃孵育过夜。PBST 洗涤3 次后，加入特异性二抗（1∶1 000）孵育1 h，PBST 洗涤后加入显影液，使用高灵敏度化学发光成像系统拍取照片。

1.3 统计学方法 miR-155 表达水平的比较采用两独立样本t检验，并采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rm155LG 转基因小鼠的建立 采用DNA 原核显微注射法制备Rm155LG 转基因小鼠。将注射有转基因片段Rm155LG 的382 枚受精卵移植给15 只假孕母鼠，其中4 只假孕母鼠怀孕［受孕率为27%（4/15）］，共生仔鼠35只［产仔率为9%（35/382）］。通过检测mRFP 表达筛选出2 只Rm155LG 转基因小鼠（编号：3313#和3314#）（图2A），并借助PCR以进一步明确筛选结果（图2B）。

图2 制备Rm155LG 转基因小鼠Fig.2 Generation of Rm155LG transgenic mice

2.2 miR-155 在Rm155LG 转基因小鼠肝脏上特异性过表达 将Rm155LG 转基因杂合子小鼠与Alb-Cre 转基因纯合子小鼠交配，检测所生后代的Luc 表达，部分子代小鼠肝脏部位可检测到Luc 信号（图3A）；与同窝对照小鼠相比，Luc 的表达可在Rm155LG/Alb-Cre 双转基因小鼠肝脏上检测到（图3B）。通过qRT-PCR检测miR-155的RNA表达，miR-155的表达水平在Rm155LG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏上显著升高（P＜0.000 1）（图3C）。以上数据均表明，Luc 和miR-155 转基因在Rm155LG/Cre 双 转基因小鼠肝脏中成功被激活。

图3 利用Cre/lox P 系统构建肝脏特异过表达miR-155 的转基因小鼠Fig.3 Liver-specific overexpression of mouse miR-155 in transgenic mice mediated by Cre/lox P system

2.3 DEN 诱导Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝癌发生情况 腹腔注射DEN 6 个月后，行肝脏大体形态学观察可见，Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝脏满布大小不一的结节，与同窝对照小鼠相比，结节数量增多，直径增大（图4A）。Western blot 结果显示，Rm155 LG/Alb-Cre 双转基因小鼠肝组织中肝癌相关基因如β-catenin、c-Myc、p21、CCNG1、GSK3β和p-GSK3β表达高于对照小鼠（图4B），初步提示miR-155 可能促进DEN 诱导的小鼠肝癌发生。

3 讨论

肝细胞肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均居于恶性肿瘤的前几位［12-13］，因此，寻找肝癌有效的治疗新靶点十分迫切。研究表明，miR-155 可能与肝癌的发生发展相关，然而目前，miR-155 在肝癌发生发展中的作用尚不明确，并且缺乏体内动物实验。本实验在Rm155LG/Cre双转基因小鼠肝脏上实现了miR-155和Luc 转基因特异性激活。通过构建条件性过表达的Rm155LG转基因小鼠，实现报告基因和转基因miR-155 在特定组织或器官被激活，可带来以下便利：首先，可借助活体生物发光成像简便地监测miR-155转基因在特定组织或器官中是否被激活。其次，由于荧光素酶在与其特有底物荧光素反应过程中可以产生大量可见光光子，在体内、体外通过检测Luc 发光强度，可间接反映出细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置［14-15］。因此，可借助活体生物发光成像检测Luc 信号的强弱，在Rm155LG/Cre 双转基因小鼠上非损伤、实时和可视化活体监测肿瘤的发生、发展、消退、复发和体内治疗效果。

图4 DEN 诱导Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝癌的发生Fig.4 DEN induces HCC in liver-specific overexpression miR-155 transgenic mice

DEN 是一种N-亚硝基化合物，常用于诱导多种肿瘤的发生发展，其在肝脏中引起损伤并诱导肿瘤发生的过程与人类肝癌的形成过程相似，因此，利用DEN 诱导小鼠肝癌的发生是理想的化学诱导性肝癌模型［16-17］。本实验利用DEN 诱导Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝癌发生，发现Rm155LG/Cre 双转基因小鼠肝脏表面癌结节增多，与肝癌发生发展相关基因的表达增高，提示DEN 诱导小鼠的肝癌不断恶化可能与miR-155 在肝脏中高表达有关。下一步笔者将继续探讨miR-155 促进DEN 诱导的肝癌发生发展的具体作用机制。

综上所述，Rm155LG 转基因小鼠的成功建立，将有助于全面解析miR-155 在多种生理和病理过程中的作用，并且Rm155LG/Alb-Cre 双转基因小鼠的建立能为揭示miR-155 在肝癌发生发展中的作用提供强大的体内研究工具。本研究还通过体内实验证实了miR-155 可以促进肝癌的发生发展，表明miR-155 可能是肝癌治疗的潜在新靶点。