PBX3基因调控p38MAPK信号对肝癌细胞生长及5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

徐卓 张萌 张志磊 贾聿明 王超 彭利

(河北医科大学第四医院肝胆外科，河北 石家庄 050011)

全球范围内的肝癌发病率及死亡率呈逐年上升趋势〔1〕。肝癌的发生发展与癌基因、抑癌基因等的异常表达密切相关。前B细胞白血病同源盒基因(PBX)3与肿瘤发生发展密切相关。PBX3表达量与前列腺癌恶性程度呈正相关〔2〕；PBX3可逆转Let-7c对结肠癌生长抑制作用〔3〕；结直肠癌中PBX3高表达，可通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号诱导细胞侵袭及迁移〔4〕。miR-33a-3p可通过靶向抑制PBX3降低肝癌细胞的侵袭及迁移能力〔5〕。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种常用的广谱抗肿瘤药物，通过影响DNA复制，参与细胞周期调控，目前已发现5-FU可协同药物、分子靶向等用于肝癌的治疗〔6〕。本研究通过干扰PBX3表达，观察其对肝癌细胞的增殖活力、凋亡和对5-FU化疗敏感性的影响，并进一步研究其分子机制。

1 材料方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 人正常肝细胞HL-7702及肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721细胞均购自美国ATCC。RPMI1640培养基、双抗、FBS、胰蛋白酶均购于美国Gibco；Bradford蛋白定量试剂盒购自北京天根生化；噻唑蓝(MTT)溶液购自美国Sigma；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒购自上海博古生物；PBX3、细胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38MAPK、磷酸化(p)-p3 8MAPK及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自美国Abcam；流式细胞仪购自美国BD；酶标仪购自上海赛默生物。

1.2细胞培养 采用含10%FBS及双抗的RPMI1640细胞培养液培养HL-7702、Huh7、MHCC-97H、HepG2和SMMC7721细胞，细胞培养箱条件设定为CO2体积分数5%、湿度分数95%和温度37℃。2～3 d换液1次，待细胞生长密度超过80%后，以胰酶消化传代。选取生长良好且处于对数期的细胞用于实验研究。人正常肝细胞HL-7702为对照细胞，Western印迹检测肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721细胞中PBX3的蛋白表达。

1.3siRNA转染 依据siRNA设计原则设计针对PBX3的特异性siRNA(si-PBX3组)，同时设计不具有干扰作用的siRNA(NC组)，均由上海吉玛合成。以2.5×104/ml细胞密度接种生长至对数期的SMMC7721细胞于6孔板，每孔2 ml细胞悬液，观察到细胞达90%以上生长融合时，根据转染试剂脂质体2000的说明书步骤，将制备的Lip2000与siRNA混合物加入6孔板，仅加入脂质体的为空白对照组，培养箱内孵育6 h后换液继续培养48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.4细胞活力检测 SMMC7721细胞分为4组处理：NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组。NC组和si-PBX3组分别转染不具有干扰作用的siRNA及靶向抑制PBX3的siRNA，5-FU组用不具有干扰作用的siRNA及10 μmol/L的5-FU处理细胞，si-PBX3+5-FU组用靶向抑制PBX3的siRNA及10 μmol/L的5-FU处理细胞。将SMMC7721细胞按照每孔3×103个密度接种于96孔板，孵育24 h后，根据上述分组处理细胞。处理48 h后，收集NC组、si-PBX3组、5-FU和si-PBX3+5-FU细胞，加入MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，常规孵育4 h，加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液在每孔细胞中，缓慢震荡混匀10 min，490 nm，酶标仪测定各组吸光度值(A值)，每组设置5个复孔，实验重复3次。

1.5细胞凋亡检测 处理48 h后，收集NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组细胞，以预冷的PBS洗涤后，胰蛋白酶消化，调整细胞密度为4×105个/ml，以500 μl的1×结合缓冲液重悬细胞后，加入5 μl的AnnexinV-FITC染色液在细胞悬浮液中，避光室温孵育15 min，再加10 μl的PI染色液，避光室温孵育5 min，加300 μl的1×结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪检测NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.6Western印迹法 处理48 h后，收集NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组细胞，加入RIPA裂解液提取各组SMMC7721细胞的总蛋白，并采用Bradford法对总蛋白定量。按照每孔道40 μg上样量将蛋白样品上样中十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中，电泳分离结束后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸入5%的脱脂奶粉中封闭1 h后，加1∶1 000稀释的PCNA、Bax、PBX3、p38MAPK和p-p38MAPK抗体，4℃孵育过夜。再加入1∶2 000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记)，室温孵育2 h，电化学发光(ECL)显色。凝胶系统扫描分析。实验重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1PBX3基因在肝癌细胞中的表达 HL-7702、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721细胞中PBX3蛋白相对表达量分别为：(0.053±0.008)、(0.226±0.020)、(0.287±0.027)、0.509±0.048)、(0.674±0.056)。肝癌细胞中PBX3蛋白表达均显著高于HL-7702细胞(P<0.05)。见图1。

2.2各组PBX3蛋白表达结果 PBX3在si-PBX3组中的表达(0.071±0.010)显著低于空白对照组(0.292±0.030，P<0.05)，而在NC组的表达(0.320±0.032)与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 Western印迹检测PBX3蛋白表达

图2 各组PBX3蛋白表达

2.3各组细胞活力比较 si-PBX3组和5-FU组细胞活力均显著低于NC组(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU组细胞活力显著低于si-PBX3组和5-FU组(P<0.05)。见表1。

2.4各组细胞凋亡率比较 si-PBX3组和5-FU组细胞凋亡率均显著高于NC组(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU组细胞凋亡率显著高于si-PBX3组和5-FU组(P<0.05)。见表1、图3。

2.5各组p38MAPK、p-p38MAPK、PCNA、Bax蛋白表达比较 si-PBX3组和5-FU组细胞PCNA及p-p38MAPK蛋白表达均显著低于NC组，Bax蛋白表达显著高于NC组(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU组PCNA及p-p38MAPK蛋白表达均显著低于si-PBX3组和5-FU组，Bax蛋白表达显著高于si-PBX3组和5-FU组(P<0.05)。4组p38MAPK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图4。

表1 各组细胞活力、凋亡率及PCNA、Bax、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白相对表达量比较

与NC组比较；1)P<0.05；与si-PBX3+5-FU组比较：2)P<0.05

图3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

图4 PBX3 siRNA或5-FU对SMMC7721细胞p38MAPK信号通路的影响

3 讨 论

如何有效增强化疗效果、提高化疗药物敏感性及减轻化疗引起的不良反应成为肿瘤治疗研究一个热点。PBX3属于含有三氨基酸突出环(TALE)的PBX家庭成员的同源基因，可与Hox蛋白互作，增强Hox蛋白结合DNA的亲和力，进而调节下游基因的转录。作为原癌基因PBX1的同源基因， PBX3与肿瘤发生发展存在潜在关系。研究表明，PBX3过表达可增加胃癌细胞增殖能力，上调公认的细胞增殖标记PCNA表达，并促进细胞的侵袭能力〔7〕。PBX3与同源盒基因(HOX)A9可协同促进白血病的生成，沉默PBX3的表达可抑制正常急性髓系白血病细胞生长及增加化疗敏感性〔8〕；以上研究结果表明，在人类肿瘤中PBX3作为癌基因起作用。葛根素联合5-FU治疗SMMC7721肝癌细胞有协同作用，并可增强5-FU对肝癌细胞作用的敏感性〔9〕；RNA干扰沉默增强子同源物(EZH)2基因可以增强Bel/FU细胞对5-FU的敏感性〔10〕。PBX3对肝癌细胞生物学特性的影响及是否增强肝癌5-FU的敏感性还未明确。

RNA干扰(RNAi)是一种新的在转录后阻断基因表达的技术，由双链RNA介导，具有高效性、特异性，与其他基因肿瘤治疗方法比较，RNAi技术呈现出更高的特异性及更强的抑制目的基因表达特性，因此，RNAi技术已用于基因功能研究、基因治疗等方面〔11,12〕。本研究结果显示，PBX3 siRNA及5-FU均可抑制SMMC7721细胞活力，诱导细胞凋亡，联合对细胞活力抑制及凋亡促进作用更明显。这提示PBX3 siRNA可抑制肝癌细胞生长及增加5-FU肝癌化疗敏感性。

MAPK信号是细胞内一条重要的信号转导途径，在大多数细胞内存在，参与细胞增殖、凋亡、周期及分化等的调控，在真核细胞中，已确定有ERK、JNK、p38MAPK和ERK5 4条MAPK信号通路，与多种人类肿瘤的发生发展密切相关，在乳腺癌、食管癌、肺癌等肿瘤中呈现持续激活表达〔13～15〕。抑制p38MAPK信号可降低肝癌细胞生长〔16〕。PCNA是常用的细胞增殖标记物〔17〕，Bax是Bcl-2家族促凋亡蛋白，在包括肝癌在内的多种肿瘤中表达降低〔18,19〕。本研究结果显示，PBX3 siRNA及5-FU均可下调p-p38MAPK及PCNA表达，上调Bax表达。这提示PBX3 siRNA抑制肝癌细胞生长及5-FU化疗增敏可能与下调p38MAPK信号有关。

综上，PBX3基因表达的抑制可降低肝癌细胞活力，诱导细胞凋亡，增强肝癌5-FU化疗敏感性，机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。本研究可能为肝癌分子靶向治疗及5-FU肝癌化疗增敏提供了一定的理论基础。