抑制PI3K/AKt信号通路对帕金森病炎症细胞模型反应的影响

邵帅 洪乐鹏 邓雪华 江梅 丁涛 姜经航 王开秀

(1荆门市第二人民医院生殖医学科，湖北 荆门 448000；2广州医科大学人体解剖教研室;3韶关学院医学院人体解剖教研室)

研究显示，帕金森病(PD)模型中有磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信号通路的抑制〔1～7〕，说明该通路参与PD发病的相关进程，而PD的神经保护类药物也是通过PI3K/AKt信号通路来发挥神经保护作用的，如：在6-羟基多巴诱导的PD模型中，人碱性成纤维细胞生长因子通过PI3K/AKt信号通路来抑制Tau蛋白磷酸化〔8〕；来自金银花的提取物类黄酮也可以通过PI3K/AKt信号通路来抑制小鼠小胶质瘤细胞(BV2)诱导的炎症反应〔9〕。尽管PI3K/AKt信号通路在PD的发病及神经保护作用中扮演重要角色，但目前尚无研究报道关于抑制PI3K/AKt信号通路对PD炎症反应的影响。本文观察抑制PI3K/AKt信号通路对PD炎症反应表达的影响。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 BV2细胞株为南方医科大学人体解剖学教研室惠赠。DMEM 高糖培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国GIBCO公司；脂多糖(LPS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体购自美国Sigma公司；LY294002(LY)购自美国Santa Cruz公司；电化学发光(ECL)液购自赛默飞公司；磷酸化(p)-AKt、AKt抗体购自Abcam公司；β-actin、辣根过氧化物酶(HRP)标记-山羊抗兔为中杉金桥生物技术有限公司的产品；Trizol 购自美国invitrogen 公司。RT-PCR 反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、RNase-free H2O均购自TakaRa公司。

1.2方法

1.2.1BV2细胞培养 BV2细胞培养于DMEM高糖培养基+10%FBS+1%青链霉素，置于37℃、5%CO2的培养箱培养，24 h换液。

1.2.2细胞处理及分组 BV2细胞消化传代以1×105/ml接种于6孔板中并加入2 ml完全培养基，24 h后换液并处理细胞，细胞共分为4组：(1)对照组：相同的时间加入等量的生理盐水；(2)LPS组：1 μg/ml LPS孵育24 h；(3)LY+LPS组：20 μmol/L LY处理0.5 h后，1 μg/ml LPS孵育24 h；(4)LY组：20 μmol/L LY处理。

1.2.3Western印迹检测 细胞经上述药物处理后，加入RIPA 裂解液〔含1%的苯甲基磺酰氟(PMSF)〕提取蛋白，酶标仪检测蛋白浓度。总蛋白与上样缓冲液进行加热变性，用40 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠(SDS)/聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，然后转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭，一抗p-AKt、AKt、iNOS、β-actin各1∶1 000稀释孵育，4℃过夜，二抗1∶1 000 室温孵育2 h，化学发光显影。

1.2.4实时荧光定量PCR检测

1.2.4.1引物设计 根据Primer-BLAST 的cDNA 序列，分别设计β-actin、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α引物序号。β-actin正义链5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，反义链5′-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-3′；IL-1β正义链5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，反义链5′-GGAAGGTCCACGGGAAAGAC-3′；TNF-α正义链5′-ATGGCCTCCCTCTCATCAGT-3′，反义链5′-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3′。

1.2.4.2RNA提取及逆转录 细胞经药物处理后，用Trizol 法提取细胞总RNA。在NanoDrop-1000分光光度计上检测RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解度，将各组的RNA通过RT-PCR 反转录试剂盒逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，添加上表中相关引物扩增各基因。ABI 7500软件检测各基因的mRNA表达水平。荧光定量PCR扩增条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每组均重复3次实验。

1.3统计学分析 采用SPSS16.0软件进行统计学分析，数据经正态性检验和方差齐性检验，采用单因素方差分析进行比较。

2 结 果

2.1LPS处理后对PI3K/AKt信号通路的影响 LPS组p-AKt/AKt蛋白比明显下调，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；LY+LPS组p-AKt/AKt蛋白比显著低于LPS组(P<0.01)。LY组p-AKt/AKt蛋白比显著高于LY+LPS组(P<0.01)。各组AKt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

2.2抑制PI3K/AKt信号通路对炎症因子表达的影响 LPS组IL-1β、TNF-α mRNA表达水平明显高于对照组(均P<0.01)；LY+LPS组IL-1β、TNF-α mRNA表达显著低于LPS组(均P<0.01)；LY组IL-1β、TNF-α mRNA表达水平明显低于LY+LPS组(均P<0.01)。见表1。

图1 Western印迹检测各组p-AKt、AKt蛋白表达

2.3抑制PI3K/AKt信号通路对iNOS表达的影响 LPS组iNOS蛋白表达显著高于对照组(P<0.01)；LY+LPS组iNOS蛋白表达显著低于LPS组(P<0.01)。LY组iNOS蛋白表达显著低于LY+LPS组(P<0.01)。见图2，表1。

图2 Western印迹检测各组iNOS蛋白表达

表1 各组p-AKt/AKt、AKt、iNOS蛋白及IL-1β 、TNF-α mRNA表达水平比较

与对照组比较：1)P<0.01；与LPS组比较：2)P<0.01；与LY+LPS组比较：3)P<0.01

3 讨 论

PD是除了阿尔茨海默病外的第二大神经退行性疾病，多见于中老年人，但近年随着环境恶化，PD也逐渐年轻化。调查显示65岁以上PD患病率为1%，85岁以上PD患病率为5%〔10〕。目前尚无有效治疗PD的方法，针对PD症状治疗的药物也无法干预PD的进程，因此从PD的发病机制寻找治疗方法势在必行，小胶质细胞参与的神经炎症导致的多巴胺能神经元死亡在PD发病及其进程中发挥重要作用〔11〕。

PI3K/AKt信号通路除调节细胞增殖、分化、代谢、抗细胞凋亡等细胞生物学作用外，还能调节学习记忆能力。研究发现PI3K/AKt信号通路与PD的联系越来越紧密，PI3K/AKt信号在PD中存在通路抑制，而且神经保护药物也是通过该通路发挥作用，如：E3泛素连接酶c-Cb1抑制小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症与PI3K/AKt信号通路有关〔12〕，法舒地尔在PD模型内也是通过PI3K/AKt信号通路依赖的方式来抑制炎症，从而发挥神经保护作用〔13〕。可以猜想单独激活PI3K/AKt信号通路也可以发挥一定抑炎及神经保护作用。

本研究中LPS刺激BV2细胞后产生炎症反应时出现PI3K/AKt信号通路的抑制，这与Dilshara等〔14〕的研究结果相一致。LY预处理抑制PI3K/AKt信号通路后则明显抑制LPS诱导的炎症反应，降低IL-1β、TNF-α mRNA表达水平；单独使用LY预处理抑制PI3K/AKt信号后则出现更为明显的炎症抑制效果；iNOS既作为促炎因子又作为氧化应激分子，在PD发病机制及加速神经死亡中发挥重要作用，LY预处理抑制PI3K/AKt信号通路后，不管是炎性反应激活中的iNOS蛋白，还是正常细胞中的iNOS蛋白表达均被明显抑制。单从文献报道的神经保护类药物可以通过PI3K/AKt信号通路来发挥对PD的神经保护作用来看，激活PI3K/AKt信号通路后应该会对PD起一定的有利作用，而本研究结果刚好与预想结果相矛盾，炎症反应中PI3K/AKt信号通路与PD的作用需进一步深入研究，也有可能与细胞的不同，药物预处理时间不同等有关。

综上所述，炎症反应中有PI3K/AKt信号通路的抑制，LY抑制PI3K/AKt信号通路后，可以明显抑制促炎因子的表达，具体的抑炎有待进一步研究查证，这为从炎性反应方向和PI3K/AKt信号通路研究PD提供了新的思考，为PD的临床治疗提供了理论基础。