miR-596在老年胃癌组织中的表达及临床意义

王福安

(平顶山学院医学院，河南 平顶山 467000)

由于胃癌恶性程度高、死亡率高及易发生转移等特征，对患者产生的影响十分严重，并且由于早期症状不明显，大部分患者在发现后病情已处于严重阶段，胃癌的早期诊断与临床治疗急需发展与创新〔1，2〕。相关研究实现，胃癌的发病率会随着患者年龄的增长而升高，老年人群的患病率极高，且老年胃癌具有组织分化程度高、肿瘤恶性程度低及生物学侵袭性弱等特征〔3〕。对老年胃癌患者的生物学行为差异等进行分析，有助于老年胃癌的诊断及个性化治疗。本研究拟分析miR-596高表达水平与低表达水平患者的临床特征，利用CCK-8实验与Transwell穿孔实验分析AGS细胞的增殖与侵袭能力，分析miR-596在老年胃癌组织中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取90例老年胃癌患者作为研究对象，分别采集患者的胃癌组织和对应的癌旁组织样本进行研究，男40例，女50例，年龄65～85〔平均(72.31±4.85)〕岁。纳入标准：①签署院内伦理委员会批准的研究实验知情同意书；②经胃镜病理检查确诊为胃部恶性肿瘤；③CT检查等明确TNM分期为Ⅰ～Ⅳ期；④年龄在65周岁以上。排除标准：①术前进行放疗、化疗或是中西医结合抗肿瘤治疗患者；②病情严重无法签署知情同意书患者；③合并其他严重器官疾病患者。

1.2仪器与试剂 普通冰箱、超低温冰箱、PCR仪、显微镜、离心机、超净工作台、消毒器、微波炉以及电子分析天平等。美国Gibco公司的RPMI1640培养基与胎牛血清(FBS)、总RNA提取试剂盒Trizol、脂质体转染试剂Lipofectamine2000、反转录试剂盒、SYBR RT-PCR检测试剂盒、miRNA检测试剂盒、miR-596mimics与阴性对照、CCK-8检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、Transwell平板。

1.3实验方法 在胃癌组织样本离体30 min之内，提取部分胃癌组织，并去除组织标本中的脂肪组织，使用含有10%FBS的RPMI1640培养基将胃粘膜上皮细胞和胃癌细胞放到培养箱中进行培养，培养条件为37℃和5%CO2，在细胞生长到90%汇合度后实施传代。

使用胰蛋白酶对研磨后的组织进行离心处理，去除上清，随后加入总RNA提取试剂Trizol及氯仿，将组织样本进行4℃高速离心处理，提取处理后的上层澄清液体，再加入等量的异丙醇，再进行离心处理，去除上清，随后使用75%的乙醇溶液进行洗涤，洗涤晾干后再加入水溶液，并测量浓度。随后依照使用说明书，将制取的RNA反转录为cDNA，再利用SYBR RT-PCR检测试剂盒，将U6作为内参，检测不同样本中的miR-596含量。实验重复3次，且每组设置3个复孔。对比胃癌组织及癌旁组织的miR-596表达水平。

提取对数期生长的胃癌细胞，并将细胞铺入孔板中培养24 h，随后实施miRNA转染，转染过程中把转染试剂与miR-596mimics与阴性对照进行混合，待静止后将其加入到对应的孔中，转染6 h后换液，并于48 h后进行后续的相关检测。

在miRNA转染完成48 h后，利用CCK-8检测试剂盒进行细胞增殖检测，严格依照试剂盒的说明书实施检测，通过酶标仪于490 mm波长处，进行吸光度值测量，再减去空白孔值，得出检测标本的细胞增殖检测结果。

Transwell穿孔实验：在miRNA转染完成48 h后，对细胞进行消化后使用不含FBS的培养基对样本进行重悬，并将相同数量的细胞放置于Transwell上层小室当中，下层放入含10%FBS的培养基，将其放置于培养箱中24 h，随后观察统计小室外层细胞核染色数量。

1.4统计学处理 使用SPSS18.0统计软件进行χ2及t检验。

2 结 果

2.1胃癌组织和癌旁正常组织中的miR-596表达水平对比 胃癌组织中miR-596平均表达水平为(1.31±0.14)，癌旁正常组织中miR-596平均表达水平为(2.21±0.44)，miR-596在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织中的表达(P<0.05)。

2.2miR-596高表达水平与低表达水平患者的临床特征对比 90例患者中miR-596高表达水平患者42例，低表达水平患者48例，两组患者的性别、肿瘤细胞分化程度差异无统计学意义(P>0.05)，淋巴结转移患者中的高表达发生率显著低于未转移患者，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者中的高表达发生率显著高于Ⅲ～Ⅳ期患者，肿瘤直径<3 cm患者中高表达发生率显著高于≥3 cm患者，老年胃癌患者的miR-596表达水平和患者的淋巴结转移情况、TNM分期及肿瘤直径具有显著的相关性(P<0.05)。见表1。

表1 miR-596高表达水平与低表达水平患者的临床特征对比分析〔n(%)〕

2.3过表达miR-596抑制癌细胞增殖与侵袭能力分析 转染miR-596胃癌细胞的增殖作用显著低于正常胃癌细胞(0.57±0.04 vs 1.01±0.08,P<0.05)，miR-596具有显著的抑制胃癌细胞增殖的作用；Transwell穿孔实验发现，转染miR-596胃癌细胞长小孔的细胞数量显著低于正常胃癌细胞(0.59±0.10 vs 1.02±0.17,P<0.05)，miR-596对于胃癌细胞的侵袭具有显著的抑制作用。

3 讨 论

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国恶性肿瘤中发病率位居首位，临床研究数据表明，胃癌好发于50岁以上的人群中。胃癌的发病会受到内外部因素的影响，遗传与基因、地域环境以及饮食结构、细菌感染和癌前病变等，是影响胃癌发病的主要因素〔4，5〕。相关研究数据显示，与胃癌患者具有血缘关系的人群中，胃癌的发病率高出4倍，胃癌的发生与发展和患者自身的抑癌基因、转移基因及凋亡相关基因具有密切的关系〔6〕。胃癌患者中大部分属于腺癌，且患者在患病早期大多数不会出现明显症状，少数患者可能出现恶心、呕吐及上消化道症状，临床表现和胃炎、胃溃疡等慢性疾病相似，常常被忽视，当检查确诊胃癌时患者已处于病情较为严重的阶段，对胃癌的早期诊断进行优化是十分必要的，对于及时发现和诊治胃癌具有重要的意义〔7，8〕。老年胃癌相较于中青年患者来说，其预后状况相对较好，患者的肿瘤分化程度较高、侵袭性相对较弱。在临床治疗中，胃癌治疗主要采取的方式有手术治疗、化疗、细胞靶向治疗及免疫治疗等，当下大部分的胃癌治疗方案中是将手术治疗作为主要方式，并使用化疗作为术后辅助治疗，患者的复发率较高，术后患者的生存率无法得到有效保障〔9〕。

miRNA是一类内源基因编码长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，能够在动植物中参与转录，对基因表达进行调控，目前为止，动植物和病毒中发现的miRNA分子已达到28 000个以上〔10〕。相关研究显示，miRNA在30%以上的基因及60%以上的蛋白中能够产生调控作用，在细胞发育、增殖及凋亡活动中能够发挥重要作用。miRNA在癌症发生与发展中的显著作用逐渐被发现和证实，相关研究显示，miR-29能够对细胞周期蛋白CDC42表达产生抑制作用，从而对细胞凋亡产生促进作用；而miR-190能够对血管内皮生长因子(VEGF)信号通路进行抑制，对于肿瘤新生血管的生成具有显著的抑制作用；miR-125b能够降低P53蛋白含量，促进癌细胞增殖作用〔11～13〕。随着分子生物学的研究和在癌症诊治中的广泛应用，miRNA在癌症诊治中发挥愈加重要的作用，基于miRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达差异，miRNA能够成为肿瘤疾病诊断的重要标志物，同时，基于miRNA在血液中的较强稳定性，能够通过对患者外周血中miRNA表达进行检测，对疾病进行诊断和临床指导〔14〕。部分miRNA表达与胃癌的负相关关系被逐渐发现和证实，例如miRNA-935、miRNA-182等，均属于具有抑癌性的miRNA，通过提升胃癌组织中的以上miRNA的表达水平，能够起到胃癌控制与治疗的作用〔15〕。

目前人类细胞中发现的miRNA分子已经达到1 100条，并且其在癌症疾病中能够发挥重要的影响。相关研究中显示，miR-596能够对口腔癌细胞当中的LGALS3-BP表达产生抑制作用，从而对MAPK信号通路产生影响，并降低癌细胞的增殖能力，对口腔癌病情发展产生积极影响〔16〕。另外，miR-596能够对结肠癌患者的P53拮抗蛋白表达产生抑制作用，从而提升P53蛋白水平，起到促进结肠癌细胞凋亡的作用。RT-PCR检测方法是目前常用的癌细胞检测方法，检测的准确性较高。本文中老年胃癌患者胃癌组织中miR-596相较于正常组织处于较低水平，表明miR-596低表达和老年胃癌患者的病情发生、发展具有密切关系，表明miR-596可以作为胃癌诊断的分子标志物，为胃癌的早期检查诊断提供更加科学、严谨的依据。同时，老年胃癌患者胃癌组织中miR-596的低表达，在一定程度上证实了miR-596可能存在一定的抗癌性，为老年胃癌的治疗提供了更加广泛的研究方向。

本研究结果进一步表明了miR-596在老年胃癌患者中的抑癌作用，为疾病诊断、监测及靶向治疗提供了更加科学的依据。

肿瘤细胞的增殖与侵袭是影响肿瘤发展的重要因素，对miR-596在老年胃癌患者胃癌细胞增殖与侵袭中的作用进行分析，能够为疾病的诊治提供更加科学的依据。本研究发现转染miR-596后胃癌细胞的增殖能力显著下降，说明miR-596具有显著的抑制胃癌细胞增殖的作用，这一作用的实现可能与其对MAPK信号通路产生的作用机制是一致的。Transwell穿孔实验结果表明miR-596对于胃癌细胞的侵袭具有显著的抑制作用。在临床治疗中，通过增加胃癌组织中的miR-596表达，能够起到疾病控制与治疗的作用。通过深入的靶基因预测技术以及相关研究，能够为老年胃癌的诊治提供更加有效的方法。