高效液相色谱法同时测定小儿补肾固表颗粒中6种成分的含量

杨辉， 潘东明， 戚欢阳， 黄亦琦， 罗友华， 张青玲， 薛征， 虞坚尔， 褚克丹

小儿反复呼吸道感染简称复感，是儿科的多发病和常见病，其发病与免疫功能低下密切相关[1]。小儿补肾固表颗粒是由补骨脂、黄芪、防风、黄芩、柴胡等中药组成[2]，具有补肾益元气、固表实肺卫之功效，用于肺肾不足，余邪未尽所致的小儿反复呼吸道感染[3-4]。可有效改善细胞免疫及体液免疫功能的紊乱状态，提高免疫功能，是一种安全、有效的防治小儿复感药物[5-7]。

本品化学成分复杂，补骨脂和黄芪共为方中君药，补骨脂中主要成分补骨脂素和异补骨脂素均有抗菌、免疫调节等作用[8-9]；黄芪中黄酮类成分具有提高免疫力的作用，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷为其主要有效成分[10]。防风为方中臣药，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风中重要的有效成分[11]，具有解热、镇痛、抗炎等作用[12]；黄芩为方中佐药，其中的黄芩苷等黄酮类成分具有抗炎活性[13-14]，是黄芩中最重要的活性成分之一。单一指标成分控制不能保证中药复方制剂的整体疗效。为了更全面的对小儿补肾固表颗粒的质量进行控制，本文建立了高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法同时测定其6种活性成分的含量，为小儿补肾固表颗粒质量标准规范化研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，四元泵，自动进样器，恒温箱，DAD紫外检测器，Chem station色谱工作站(美国Agilent公司)，Agilent Zorbox Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司)；XS205电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg)；KQ-500VDB型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)。

1.2 药品 甲醇(批号：13080417，色谱纯，Tedia公司)；乙腈(批号：13020466，色谱纯，Tedia公司)；甲酸(批号：20100605，分析纯，广东光华化学厂公司)；哇哈哈饮用纯净水(批号：20171114，厦门哇哈哈饮料公司)。对照品(升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素，成都曼斯特生物科技公司，批号：MUST-18040310，MUST-18031920，MUST-18031502，MUST-18010410，MUST-17092820，MUST-17062204，纯度均≥98%)。小儿补肾固表颗粒为厦门市医药研究所自制，3批(批号：20180401，20180424，20180425)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件色谱柱 Agilent Zorbox Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0～5 min，10%～15% A；5～7 min，15%～16% A；7～9 min，16%～16.2% A；9～15 min，16.2%～16.3% A；15～22 min，16.3%～17.5% A；22～25 min，17.5%～31% A；25～42 min，31%～40% A；42～54 min，40%～60% A；54～65 min，60%～95% A)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长254 nm和280 nm。

1.3.2 对照品溶液的配制

1.3.2.1 对照品储备液的配制 分别精密称取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素对照品适量于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度分别为0.882、0.304、0.860、3.010、0.762、1.016 g/L的升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素对照品储备液。

1.3.2.2 混合对照品溶液的配制 分别精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇定容，分别制成浓度为88.20、30.40、86.00、1 204.00、60.96、81.28 mg/L的升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素混合对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备 取小儿补肾固表颗粒样品1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20 mL甲醇，称定质量，超声处理(频率80 Hz，功率100%)40 min，放冷，称量，用甲醇补足减失质量，摇均，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

1.3.4 阴性对照样品溶液的制备 按小儿补肾固表颗粒处方比例及工艺，分别制备缺少防风、黄芪、黄芩、补骨脂及空白的阴性对照样品，并按“1.3.3”项下方法制备各阴性对照样品溶液。

1.4 专属性 分别移取“1.3.2～1.3.4”项下的各溶液适量，依次注入高效液相色谱仪，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

1.5 线性关系考察 分别精密吸取“1.3.2.2”项下的混合对照品溶液用甲醇稀释成6个不同质量浓度的对照品溶液，分别按“1.3.1”项下色谱条件各进样10 μL，记录相应峰面积，以各成分对照品质量浓度(mg/L)为横坐标(X)，以峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数。将混合对照品溶液稀释至一定浓度进样，使S/N为3及10的各成分对照品质量即为检测下限及定量下限。

1.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。

1.7 重复性试验 取同一批次样品(批号：20180424)，按“1.3.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，于“1.3.1”项下色谱条件进行分析。以外标法计算样品中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素的平均质量分数和记录峰面积。

1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20180424)，在室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h后在“1.3.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。

1.9 加样回收率试验 精密称取已测知含量的同一批号(批号：20180424)样品9份，每份约1 g，分成3组，每组3份，分别加入高、中、低3个质量浓度的对照品混合液，按照“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。

1.10 样品含量测定 取各批号的小儿补肾固表颗粒样品，精密称定，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，于“1.3.1”项下色谱条件进行测定，采用回归方程计算含量。

2 结果

2.1 各样品色谱测定结果 升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素、异补骨脂素的专属性较强，阴性对照溶液图谱显示阴性样品无干扰，该方法专属性较好，见图1(封三)。

2.2 6种成分的线性关系考察结果 见表1。

表1 6种成分的线性关系考察结果

表1结果表明，6种成分在一定质量浓度范围内与峰面积呈较好的线性关系。

2.3 精密度试验结果 样品中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素峰面积的RSD分别为1.37%、1.01%、1.16%、0.69%、1.22%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验结果 样品中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素的平均质量分数分别为0.56、0.14、0.45、13.71、0.34、0.86 mg/g；RSD分别为2.21%、2.32%、2.31%、2.05%、2.10%、1.34%。

2.5 稳定性试验结果 样品中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、补骨脂素和异补骨脂素峰面积的RSD分别为2.40%、1.88%、2.26%、1.14%、1.64%、1.65%，结果表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

2.6 样品含量测定结果 3批次中黄芩苷含量最高，且不同批次中该成分含量差异较大，其余5种成分含量较低，在不同批次中成分含量差异较小，见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/g)

2.7 加样回收率试验结果 本测定方法的加样回收率良好,见表3。

3 讨论

本研究首次建立了HPLC法同时测定小儿补肾固表颗粒中6种指标成分的方法，该方法高效、准确，为小儿补肾固表颗粒的质量控制提供了研究基础。

中药复方的药效物质基础是十分复杂的，单指标的含量测定难以客观体现全方的药效成分，相对而言多成分指标的定量测定更适合中药复方的质量评价。本实验中6种成分的选择是基于2015年版《中国药典》[15]并参考相关文献方法[8-14]。一方面考虑到其药理活性，具有免疫调节、抗炎等活性，另一方面是参考药典中相关药材的指标性成分，最终确定补骨脂中指标成分为补骨脂素及异补骨脂素，黄芪的指标成分为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，防风的指标成分为升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷，黄芩的指标成分为黄芩苷，通过多成分含量测定客观反应小儿补肾固表颗粒的质量。

表3 6种加样回收率试验结果

本实验测定的小儿补肾固表颗粒中的6种成分涉及3类成分，包括黄酮类、香豆素类及色原酮类，各自的最大吸收范围为238～280 nm。参考2015版药典中相关成分检测波长的选择[10]及经全波长扫描并兼顾6种成分最大吸收波长，确定检测波长，升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、补骨脂素和异补骨脂素为254 nm，黄芩苷为280 nm，以建立色谱条件。由于黄芪中黄芪甲苷及柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等皂苷类成分是紫外末端吸收，最大吸收波长是203 nm左右，干扰较大，常运用蒸发光散射检测器测定，考虑在下一步实验中采用蒸发光散射检测器对小儿补肾固表颗粒中的皂苷类成分进行测定，因而本实验并未采用紫外检测器对该类成分进行测定。

对供试品溶液制备条件进行了系统考察。首先对超声、冷浸、加热回流3种提取方式进行考察，其中超声提取的方式最为简便、高效；其次分别选取甲醇、乙醇、水为溶剂，对同一样品超声提取40 min，比较待测化合物的峰面积，发现甲醇做提取溶剂时，各色谱峰的峰面积总和较大。综合分析最终确定了采用甲醇超声提取的方式。

对色谱条件的选择进行了系统考察。本实验首先考察了甲醇-水，乙腈-水等不同流动相体系，结果发现乙腈-水溶液洗脱体统下各成分分离度较佳，且梯度洗脱过程中基线平稳，因此选择乙腈-水系统。为了改善峰形，把流动相调整为弱酸性，提高分离度。其次考察了在水相中添加0.1%、0.15%、0.2%、0.4%的甲酸溶液，结果发现0.2%的甲酸溶液可以达到改善峰形及提高分离度的效果，因此选用0.2%磷酸水溶液作为流动相的水相。最后考察了5、10、15、20 μL进样量，结果表明10 μL进样量时峰形好，基线平稳。