毛蚶多糖提取及脱色工艺的优化

(皖南医学院寄生虫教研室，安徽 芜湖 241002)

毛蚶(Scapharca subcrenata)属于软体动物门双壳纲(Bivalvia)、魁蛤目、魁蛤科、毛蚶属，肉质丰富，含有丰富的天然活性成分，具有很大的食用药用价值，是重要的海洋资源，多糖就是天然活性成分之一。天然多糖是天然产物中的一大类，又称多聚糖，是生物体重要组成部分，重要的天然产物资源之一[1]。天然多糖有抗氧化[2-3]、抗炎[4]、抗肿瘤[5-6]、抗辐射[7]、提高免疫力[8]等生物学功能，对治疗和预防多种疾病具有巨大潜力。

天然多糖最常用的提取方法主要有水浸提法、酸碱提法、超声波辅助提取法、复合酶提取法等，不同方法各有各的优缺点[9-10]。贝类属于动物，含有大量蛋白质，所以贝类多糖提取与纯化比植物多糖困难。为了防止多糖的结构在反复提取与纯化过程中被破坏，本研究采用简单、经济且不破坏多糖结构的热水浸提法提取毛蚶多糖[11]。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 毛蚶(产地中国扬州)，丙酮、无水乙醇、 蒽酮、浓硫酸、双蒸水、 三氯甲烷、 正三醇、 H2O2(试剂均为分析纯)；D105大孔树脂 ，10—20目活性炭(合肥睿捷生物有限公司)，考马斯亮蓝试剂盒(合肥睿捷生物有限公司)。

1.2仪器 SHKE6000-8CE震荡仪(美国赛默飞世尔公司)、TP-8XL真空冷冻干燥机(美国SP Scientific公司)、Infinite 200PRO多功能酶标仪、 Hei-VAP HL Adv真空旋转蒸发仪(德国德祥科技有限公司)、J-26XP离心机(美国Beckman Coulter)。

1.3提取工艺

1.3.1毛蚶多糖提取 取新鲜活毛蚶2000 g去壳，取肉反复清洗，匀浆，匀浆液加等倍体积丙酮浸泡24 h脱脂，倒去丙酮冷冻真空干燥得脱脂毛蚶干粉，准确称取脱脂后的毛蚶干粉2 g，以提取温度、浸提时间、料液比为可变因素水浴搅拌提取。将提取液以6000 r/min上离心机，离心20 min，取上清液并旋转蒸发至原体积的1/3，加4倍体积无水乙醇4℃过夜，倒去乙醇收集沉淀，沉淀分别用丙酮和无水乙醇反复清洗3次，双蒸水复溶即得毛蚶粗多糖溶液。

1.3.2脱蛋白 采用较温和的sevage(三氯甲烷与正三醇4∶1)法[12]脱蛋白， sevage试剂与多糖溶液3∶1(V/V)置于摇床剧烈摇动2 h后5000 r/min离心20 min，溶液分三层，用吸管将上层多糖溶液吸出，重复此步骤直至无中间蛋白层析出。

1.3.3脱色

1.3.3.1脱色率测定 用全自动酶标仪在420 nm波长下检测毛蚶多糖脱色前后吸光值(OD)，根据公式脱色率(%)=(A1-A2)/A1×100%，A1是脱色前的多糖溶液的OD值，A2是脱色后的OD值。

1.3.3.2活性炭脱色 准确称量0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g、0.30 g、0.35 g、0.40 g活性炭，然后分别置于8支试管中，向各试管加入已脱蛋白的多糖溶液3 ml， 60℃水浴60 min， 10 000 r/min离心20 min,分别吸取各管上清液测量各试管中多糖脱色率及多糖损失率。

1.3.3.3过氧化氢(H2O2)脱色 向5 ml多糖溶液中加入不同浓度的双氧水(H2O2)溶液(4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%)，于60℃水浴60 min，分别测量各管多糖脱色率及损失率。

1.3.3.4大孔树脂脱色 分别以浓度为0.02 g/ml、0.04 g/ml、0.06 g/ml、0.08 g/ml、0.10 g/ml、0.12 g/ml、0.14 g/ml大孔树脂脱色，分别检测各管多糖脱色率及损失率。

1.3.4毛蚶多糖正交试验设计 见表1。

表1 毛蚶多糖正交试验因素水平

1.3.5多糖的测定 通过硫酸-蒽酮法测多糖含量。 硫酸蒽酮溶液配制：称取0.1 g蒽酮置于50 ml容量瓶中用浓硫酸定容至刻度线，并用超声波混匀，得0.02 g/ml硫酸蒽酮溶液置于棕色玻璃瓶中备用。标准葡萄糖溶液配制：将无水葡萄糖在105℃下干燥至恒重，准确称取200.00 mg置于1 L容量瓶中，双蒸水定容至刻度线，得0.20 mg/ ml标准葡萄糖溶液。标准曲线绘制 ：取5支10 ml洁净试管分别加入0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml标准葡萄糖溶液，用双蒸水将体积不足0.50 ml的试管补至0.50 ml，向各试管中加硫酸蒽酮溶液2.00 ml并用橡皮塞塞紧试管口，小心充分摇匀后置于100℃沸水中水浴10 min，取出试管冰浴10 min。全自动酶标仪在625 nm波长测OD值，并根据OD值绘制标准曲线。根据标准曲线得回归方程为：y=3.5957x-0.0059，相关系数r2=0.9947。多糖含量可根据回归方程计算，多糖提取率(%)=每份样品所含多糖质量/每份原料的质量×100%。多糖损失率(%)=(脱色前的多糖量-脱色后的多糖量)/脱色前的多糖量×100%。

2 结果

2.1毛蚶多糖的提取 毛蚶多糖提取工艺优化，以液固比、提取的温度、提取的时间3个因素做正交试验，见表1、表2。由表3可知液固比对毛蚶多糖的提取率影响最大，提取的时间对毛蚶多糖提取率影响最小，影响因素大小依次为固液比>提取温度>提取时间，从表2可知毛蚶多糖提取最优工艺是A2B3C1，液固比为35∶1(ml/g)、温度为80℃、时间为2 h时提取率最高，为9.20%。

表2 毛蚶多糖提取正交试验结果

表3 毛蚶多糖正交实验结果方差分析

2.2H2O2脱色 加入H2O2浓度为12%时脱色效果最好，脱色率为58.90%，多糖损失率为28.90%。见图1。

图1 H2O2浓度对多糖脱色率及损失率的影响

2.3活性炭脱色 活性炭添加量为0.08 g/ml时脱色效果最佳，脱色率为61.90%，多糖损失率为32.70%。见图2。

图2 活性炭对多糖脱色率及损失率的影响

2.4大孔树脂脱色 添加大孔树脂含量为0.1 g/ml时，脱色率为66.60%，多糖损失率为27.50%。见图3。

图3 大孔树脂对多糖脱色率及损失率的影响

3 讨论

贝类多糖提取有热水浸提法、复合酶提法、酸碱提取法、超声波辅助提取法等，酸碱提取法需严格控制pH值且可能破坏多糖结构，复合酶提取法提取效率高但可能会引入新的蛋白质，且对提取温度及pH值要求严格，热水浸提法虽然提取率相对低，但具有操作简单且不破坏多糖结构等优点，为最常用的多糖提取方法。本研究通过热水浸提法对毛蚶多糖在不同液固比、提取温度、提取时间进行正交试验探讨毛蚶多糖最佳提取条件。

多糖脱色方法主要有H2O2[13]、活性炭[14]、大孔树脂[15]3种工艺，3种脱色工艺对毛蚶多糖脱色率及多糖损失率分别为：H2O2脱色率为58.90%，多糖损失率为28.90%；活性炭脱色率为61.90%，损失率为32.70%；大孔树脂脱色率为66.60%，多糖损失率27.50%，其明显优于活性炭及H2O2脱色工艺。 H2O2脱色是利用氧化反应使有色物质失去颜色，脱色效果明显，但有色物质仍然存在于多糖溶液中且H2O2影响硫酸蒽酮法测多糖，需要加热去除后方能用硫酸蒽酮法测多糖含量；活性炭脱色操作方便，快捷，价格低廉，脱色效果明显，应用最广泛，活性炭粉末混入溶液中需高速离心后去除；大孔树脂脱色效果最好且多糖损失率低，但价格较活性炭和H2O2昂贵且脱色时间长，操作复杂。

综上所述毛蚶多糖热水浸提法最佳提取工艺为液固比35∶1(ml/g)、温度为80℃、提取时间为2 h时，提取率最高为9.20%。大孔树脂脱色的脱色率为66.60%，明显优于H2O2法(58.90%)和活性炭(61.90%)，大孔树脂脱色多糖损失率(27.50%)较H2O2法(28.90%)和活性炭法(32.70%)低。毛蚶多糖提取工艺的研究为毛蚶多糖的组分、分子量、分子结构及生物活性研究提供基础。