环境中自由及结合态雌激素的酶降解转化研究进展

余薇薇 杜邦昊 张敏讷 万巧玲 杨硕 赵晨菊

（1. 重庆交通大学河海学院 水利水运工程教育部重点实验室，重庆 400074；2. 国家城市供水水质监测网重庆监测站，重庆 400060）

近年来，内分泌干扰物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）环境问题引起全球范围的密切关注和重视，是国际环境科学领域研究的前沿和热点课题之一，美国、欧盟、日本、世界卫生组织（WHO）、联合国环境规划署（UNEP）、经济合作与发展组织（OCED）等国家和组织已制定管理法规和管控措施，中国也在《水污染防治行动计划》（国发［2015］17号）中提出严格控制环境激素类化学品污染并评估风险，实施管控措施［1-3］。类固醇雌激素（Steroid estrogens，SEs）可分为天然和人工合成两大类，是雌情活性最强、最受关注的一类EDCs，在环境中被广泛检测出，主要来源于城市污水处理厂和集约化畜禽养殖场［4-7］。环境中极其微量的SEs便可强烈干扰人类和动物的内分泌系统，导致发育、生殖、神经、免疫等问题［1］，长期暴露于高浓度SEs环境中还会导致鱼类雌性化、雌雄同体、植物生长损伤、微生物功能及群落多样性变化等问题［8-9］，而且不同SEs间存在着复合毒性协同效应，造成的危害更大［10］。酶具有催化效率高、活化能低、反应条件温和、环境友好等特点，被誉为“绿色催化剂”，在SEs的去除中起到重要作用并广受关注［11-17］。本文总结了环境中酶对自由及结合态SEs的去除作用及其反应机理，阐明不同形态SEs的主要酶降解、转化路径，并对酶在环境中SEs去除的应用进行了展望，以期对环境中两种形态雌激素的酶降解转化的研究提供理论借鉴。

1 环境中降解转化SEs酶的基本性质

环境中天然SEs可分为自由态（Free estrogens，FEs） 和 结 合 态（Conjugated estrogen，CEs）， 其结构示意如图1所示。天然SEs降解、转化过程常用的酶主要分为两大类：（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases），通过催化氧化FEs形成聚合产物，如过氧化物酶（Peroxidases，PODs，EC 1.11.1.X）和漆酶（Laccase，Lac，EC 1.10.3.2）［18-21］；（2）水解酶类（Hydrolases），通过解离结合基团将CEs水解为相对应的FEs，如芳基硫酸酯酶（Arylsulfatase，ArySTS，EC 3.1.6.1）和β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUSB，EC 3.2.1.31）［22-25］。典型 SEs降解、转化酶的物理化学性质及三维结构，见表1和图2。除以上几种酶外，还有一些细菌产生的酶对SEs具有降解、转化作用，如亚硝化单胞菌属（Nitrosomonassp.）可产生单加氧酶（Monooxygenase）、诺卡氏菌属（Nocardiasp.）及不动杆菌属（Acinetobactersp.）可产生双加氧酶（Dioxygenase）、红球菌属（Rhodococcussp.）及鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.）可产生单加氧酶、双加氧酶、羟基类固醇脱氢酶（Hydroxysteroid dehydrogenase，HSD）等［26-27］。

图1 天然SEs结构示意图

2 氧化还原酶对FEs的降解转化作用

FEs主要包括雌酮（Estrone，E1）、17α-雌二醇（17α-Estradiol，17α-E2）、17β-雌二醇（17β-Estradiol，17β-E2）、雌三醇（Estriol，E3）。氧化还原酶去除FEs的主要作用机制为氧化耦合反应，催化FEs A环酚羟基形成高氧化潜能、高活性的C2、C4位自由基与C3位苯氧自由基等自由基中间体（图3），通过C-O-C、C-C共价键自耦合、相互耦合形成二聚体，同时受到溶剂类型、pH、A环取代位置等影响［14，18，21，31-32］。FEs A 环 C3 位氧原子的电荷密度较高而自旋密度较低，因此与C-O-C键相比，在动力学上更有利于形成C-C键聚合产物［33］。二聚体可继续形成自由基，作为酶的底物继续氧化耦合生成三聚体、低聚体，甚至高聚体，但聚合物的溶解度随相对分子质量增加急剧降低，难以进一步耦合形成高分子量的聚合物［32，34］。氧化还原酶催化FEs生成的聚合产物溶解度较低，在污水处理过程中易于通过吸附、过滤、沉淀等作用被去除。氧化还原酶的催化能力通常与氧化还原电位（表1）和糖基化程度相关，高氧化还原电位有利于酶对SEs的催化氧化，在一定范围内，酶的稳定性随糖基化程度的增加而提高，其中LiP的糖基化程度较高，为20%-30%，高于HRP（18%-22%）、Lac（10%-20%）和MnP（5%-15%）［35-36］。PODs和 Lac催化机理的主要区别在于电子受体，通常PODs以H2O2作为电子受体催化其活性，同时还需要辅酶因子的参与，而Lac以空气或水中的氧分子作为电子受体，不需额外添加氧化剂［17，34，37-39］。FEs在 Lac 催化体系中的去除速率低于PODs，但PODs不稳定，在复杂基质及过量H2O2条件下易于失活，而Lac的稳定性更强［34］。另外，与A环C3位相结合的CEs（如E1-3S、17β-E2-3S、E1-3G、17β-E2-3G）受到硫酸盐或葡糖苷酸盐基团的保护，不易被氧化还原酶催化氧化形成自由基［22］。不同基质中氧化还原酶对FEs的去除效率如表2所示。

表1 典型SEs降解、转化酶的主要物理化学性质［28］

图2 典型SEs降解、转化酶三维结构示意图［30］

2.1 过氧化物酶的降解作用

PODs在自然界中分布广泛，可由动植物、真菌、细菌产生，根据是否含血红素分为血红素（Heme-peroxidases）及非血红素过氧化物酶（Nonheme peroxidases）［51-52］。在 FEs的 催 化氧化中应用较多的PODs主要为血红素过氧化物酶，包括两大类：（1）真菌分泌的胞外木质素降解酶（Lignin modifying enzymes，LMEs），如 LiP、MnP、VP。（2）植物产生的HRP［51］。PODs的催化机理为：血红素蛋白被H2O2或小分子过氧化物氧化为化合物I（卟啉π阳离子自由基氧铁基团，FeIV=O·+），随后化合物I从底物得到一个电子还原为化合物Ⅱ（氧铁基团，FeIV=O），再氧化底物得到一个电子将酶还原为基态FeIII，其中最后一步为限速步骤［13，53］，FEs被催化氧化生成自由基后通过耦合反应生成聚合产物。

表2 氧化还原酶对不同基质中FEs的去除

2.1.1 木质素降解酶 LiP在酸性条件下催化去除FEs效果较好，Wang等［41］实验结果表明，在pH3，0.2 mol/L H2O2条件下，120 U/L LiP对2.7 mg/L E1和17β-E2的去除率为60%-90%。Mao等［19］实验表明在 pH4.6，0.05 mmol/L H2O2条件下，2.5 mg/L 17β-E2可被20 U/L LiP完全去除，主要产物为17β-E2低聚物，少量转化为中间产物E1。藜芦醇作为白腐真菌（White-rot fungi，WRF）的次生代谢产物以及与LiP共生的活性底物，具有较强的氧化能力，在LiP催化FEs过程中可被氧化成阳离子自由基，保护LiP避免失活并增强其活性，且对失活的LiP有一定的恢复作用［19，32，40］。无藜芦醇时，初始浓度为5 mg/L的17β-E2反应60 min后去除率仅为40%，而添加藜芦醇能够提高LiP对FEs的催化去除效率，反应 20 min 便能将 5 mg/L 17β-E2 完全去除［19］。

MnP是一类以多种形式存在的糖基化血红素过氧化物酶，其结合位点的结构与其他PODs有所不同，通过将Mn2+氧化为Mn3+完成催化氧化［54］。Tamagawa等［44］试验结果表明，经600 U/L MnP处理1 h后，0.01 mmol/L E1被完全去除，2 h后雌激素活性得以完全去除。

VP是一种混合酶，结合了LiP和MnP两种酶的底物特异性，在H2O2、Mn2+以及底物的共同作用下，将Mn2+氧化为Mn3+，催化氧化FEs形成聚合产物［21］。Eibes等［42］考察了 VP 对 E1 和 17β-E2 的去除，结果表明在低酶活性（10 U/L）条件下，反应25 min内两种化合物能够被完全去除。Taboada-Puig等［21，43］实验结果表明，在最优条件下，VP可去除污水中高浓度（1.3-8.8 mg/L）及环境浓度（1.2-6.1 μg/L）的E1和17β-E2，并形成二聚体、三聚体和羟基雌酮（Hydroxyestrone，OH-E1）等产物。

2.1.2 辣根过氧化物酶 HRP是一种含铁卟啉辅基的PODs，含有两个不同的金属中心：血红素和两个钙原子，主要由植物分泌，在辣根（Horseradish）中含量最高，并因此而得名［35，55］。Auriol等［18，56］研究发现在pH为7，温度为25℃条件下，被H2O2激活后，32 U/L HRP在1 h内可去除人工污水中97%的100 ng/L E1、17β-E2或E3，反应5 h后去除率为99%；但在实际污水中，去除相同浓度的FEs需添加8 000-10 000 U/L HRP，说明复杂污水基质成分使得HRP氧化能力受到抑制，从而显著影响了FEs的氧化去除。

值得注意的是，H2O2作为PODs的电子受体，同时又是这几种酶的抑制剂，过量H2O2会使反应过程中过渡态化合物形成无反应活性的化合物III（铁超氧化物，FeIII=O2·-），称之为“自杀性失活”（Suicide inactivation）［13，57］。而作为一种混合酶，VP 的“自杀性失活”更加复杂，由于其存在3个氧化位点及多个催化产物，对H2O2浓度最敏感［57］。有研究表明，添加稳定剂可保护酶活性避免失活，如聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、聚乙烯（Polythene，PE）、明胶（Gelatin）、多糖（Polysaccharide）等［13，36］。

2.2 漆酶的催化氧化作用

Lac是一类多酚氧化酶，自然界中Lac可由高等植物、昆虫、细菌、真菌产生，其中真菌漆酶（Fungal Laccase）的底物特异性低，氧化能力强，应用最为广泛［14，37，51-52］。Lac 催化活性中心通常含有 4 个铜离子，三环的铜簇位点以空气或水中的氧分子作为电子受体，形成自由基后，T1铜中心参与FEs单电子氧化，将O2还原为水，生成C-O-C、C-C聚合产物［11，55，58］。FEs在 A 环 C3 位含有酚羟基，能够被Lac催化产生苯氧自由基，通过氧化耦合反应形成二聚体、三聚体，有研究表明Lac还可将17β-E2氧化为 E1［20，39，50，59］，而与之相反，Singh 等［48］在反应产物中未检测出E1和E3。

Lloret等［39］研究发现，在水相反应体系中，pH4时Lac的酶活性最高，但稳定性较低，而其酶活性在pH7时较低，但稳定性高，同时可观察到反应初期Lac在pH4时有显著失活，而在pH7条件下，6 h内酶活性较稳定。Singh等［55］实验研究表明，在2 500 U/L Lac条件下，在水相体系中反应5 h后0.2 mg/L 17β-E2去除率为93%，而在土壤中去除率为87.1%。土壤含水率对Lac处理效果也有影响，经24 h 10 U/g Lac处理后，非饱和土壤中0.2 mg/g 17β-E2去除率仅为32.1%，而在饱和土壤中去除率达到62.6%，这可能由于Lac酶分子在水相中有利于与17β-E2接触，从而去除效果增强［48］。在pH为7，温度为25℃条件下，20 000 U/L Lac在1 h内可完全去除人工及实际污水中100 ng/L E1、17β-E2或E3，实验结果表明其催化FEs耦合反应受污水基质成分的影响较小［46］。有研究表明在相同浓度下，Lac催化氧化E1的反应速率仅为17β-E2的60%，其区别在于二者在C17位与Lac的亲和性［22］。Lac的稳定性在水相和土壤体系中有较大差异，虽然在水相（0.46 h-1）中其失活速率比在土壤（0.003 1 h-1）中快很多，但水相中Lac对17β-E2的去除速率比在土壤中高100多倍［48］，Lac在土壤中的活性持续时间较长、稳定性强的特点弥补了其反应速率慢的缺点。

漆酶介导反应体系（Laccase mediator system，LMS）指Lac在介体和氧分子存在时进行催化氧化的反应体系，介体的氧化还原电位较高，可分为天然及人工合成介体，如紫脲酸（Violuric acid，VA）、丁香醛（Syringaldehyde，SA）、1-羟基苯并三氮唑（1-hydroxy-benzotriazole，HBT）、2，2-联氮 -二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfnoic acid），ABTS）等［45-46，60-62］。介体在酶和目标化合物间起到“电子穿梭”的作用，作用机制主要包括氢自由基转移、电子转移以及离子氧化，添加介体可提高FEs的氧化程度，从而增强 Lac 催化去除 FEs反应［17，61，63］。Auriol等［46］实验结果表明，当Lac酶活性低于20 000 U/L时添加HBT可提高17β-E2的去除效率，而当酶活性高于20 000 U/L时，两种条件下17β-E2的去除率没有明显差异。Sei等［64］实验结果表明，在无介体条件下，300 U/L Lac反应6-12 h后可完全去除20 mg/L 17β-E2和E3，24 h后E1的去除率为90%，添加介体ABTS或HBT后E1仅在3 h内可被Lac完全去除。Lloret等［62］实验表明，不添加介体条件下，经Lac处理24 h后17β-E2得以完全去除，而E1不易去除，在Lac-VA、Lac-HBT和Lac-SA体系中E1的去除率分别为100%、88%和74%。在以后的研究中，应探索成本低、性质稳定、毒性低及水溶性好的介体。

2.3 有机质对氧化还原酶催化FEs的影响

土壤与水体环境中富含有机质，有研究表明高浓度有机质可显著降低FEs的酶催化去除速率，这是由于有机质含有大量酚类官能团，形成自由基后可与FEs及其自由基相互耦合，形成交叉耦合化合物，从而抑制FEs自耦合产物的形成［33-34，65-66］。Mao等［32］试验证实，藜芦醇对LiP催化能力的增强会受到有机质的抑制。当有机质和藜芦醇同时存在时，二者在LiP表面活性位点产生竞争，导致17β-E2的去除率有所降低，这是由于有机质和17β-E2的交叉耦合反应抑制了藜芦醇对LiP去除17β-E2的增强作用［23，40］。Huang 等［65］研究了有机质对 HRP去除17β-E2的影响，发现有机质不仅抑制17β-E2的去除，还会影响17β-E2氧化自耦合产物二聚体、三聚体的形成。Sun等［66］研究发现有机质可与Lac表面活性位点竞争或与17β-E2结合，从而抑制17β-E2的酶催化氧化去除，且其抑制率随有机质浓度增加而升高，有机质浓度为50 mg/L时，Lac对17β-E2的去除率不足5%。夏青［55］通过试验研究表明，有机质对HRP去除E1、17β-E2的抑制作用并不明显，去除率仍高于80%，而在Lac催化体系中，有机质对E1、17β-E2的去除有抑制作用，说明有机质对HRP活性的影响较小。

3 水解酶对CEs的降解转化作用

FEs羟基可与硫酸盐或葡糖苷酸盐通过酯化作用形成CEs，其中单羟基化合物E1的结合态为单一形式，多羟基化合物E2、E3则可与一个或多个结合基团形成硫酸盐（CSEs）、葡糖苷酸盐（CGEs）、硫酸盐-葡糖苷酸盐（CS-GEs）形式的CEs。与FEs相比，CEs的水溶性、迁移性高，而吸附性较低。研究普遍认为CEs无生物毒性，但其解离后又重新生成雌情活性高的FEs，潜在的生态风险不应被忽视。CEs结合基团的解离主要为ArySTS和GUSB的作用，其活性与温度及微生物丰度密切相关，酶催化条件下CEs的解离在热力学上不可逆［16］。CGEs可被GUSB解离为相对应的FEs，ArySTS通过水解硫酯键将CSEs酶解为其对应的FEs［25，67］。研究表明，GUSB和ArySTS活性与有机质含量、土壤黏粒显著相关［23，68-69］。目前有关CEs酶降解、转化的研究多集中在E1及E2的结合态，而有关E3结合态形式酶解的研究相对较少。

3.1 芳基硫酸酯酶的水解作用

ArySTS可由微生物、动植物分泌，在污水及活性污泥中活性和含量水平较高［70-71］。土壤中ArySTS主要以吸附态存在于腐殖质、黏土矿物，稳定性增加且不易失活，而很少以游离态形式存在［68］，Bai等［72］研究也表明ArySTS仅在土壤吸附相中保持活性，而在水相中几乎没有活性。水体中ArySTS主要来自底泥微生物的分泌，也可通过径流、合流制污水管网溢流等方式携带产生ArySTS的微生物进入水体［25，70］。然而，由于环境中ArySTS活性与丰富度水平相对较低，CSEs硫酯键的解离作用通常较弱［73］。Liu等［74］的实验结果表明，在1 mL pH5的缓冲液，55℃条件下，添加50 μL ArySTS反应3 h后，E1-3S和E3-3S的解离效率超过75%，而17β-E2-3S的解离效率低于60%。Bai等［72，75］实验表明，ArySTS对17β-E2-17S的解离作用仅为A环羟基化作用的1/10，主要产物为 OH-17β-E2-17S 和 diOH-17β-E2-17S。Ma和Yates［76-77］也发现农田土壤、河水及沉积物中17β-E2-3S主要通过C17位羟基的氧化生成初级代谢产物E1-3S，而酶的解离作用次之。另外，氧化还原条件也会影响ArySTS的活性，Zheng等［78］测定了奶牛养殖场污水17α-E2-3S的转化产物，结果表明，在有氧条件下主要通过D环C17位的羟基氧化为酮基，从而生成E1-3S，而在厌氧条件下A环C3位硫酯键的酶解占据主导代谢地位。

值得注意的是，芳基磺基转移酶（Arylsulfotransferase，ArySULT，EC 2.8.2.1）与ArySTS的作用则相反， 能 够 将 FEs重 新 转 化 为 CSEs［67］。Goeppert等［67，79］研究了土壤中17β-E2的转化路径，结果表明17β-E2可先降解为E1，随后在ArySULT的作用下转化为E1-3S。

3.2 β-葡糖苷酸酶的水解作用

GUSB属糖苷类水解酶，细菌、真菌及高等动植物均可产生，广泛存在于污水、活性污泥、土壤、沉积物中［23］。在河水及沉积物中，Ma和Yates［76-77］观察到17β-E2-3G主要通过C3位结合基团的解离生成17β-E2，而在农田土壤中主要为C17位羟基氧化作用生成E1-3G，这可能由于土壤中GUSB含量水平不足所致。Kumar等［80］实验结果表明，在河水中反应5 d后，E1-3G完全解离为E1，而仅有64%的17β-E2-3G解离为17β-E2及随后的转化产物E1，这可能由于GUSB对两种CGEs的解离存在差异。

粪大肠菌群，例如埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）可合成GUSB和ArySTS，从蜗牛（Helix pomatia，H. pomatia）中提取的GUSB-ArySTS混合酶也广泛应用于 CEs的酶解及检测［71，74］。E. coli合成的ArySTS较少且活性、亲和性相对较弱，H.pomatia中提取的GUSB-ArySTS混合酶中ArySTS活性也相对较低［23，81］，因此与 CGEs相比，CSEs在环境中的稳定性和持久性更强［80，82］。Ben 等［82］实验表明，10 μmol/U酶抑制剂STX 64和D-葡糖二酸-1，4-内酯可分别有效抑制污水中ArySTS和GUSB活性，从而阻碍CEs的解离。结合基团（硫酸盐或葡糖苷酸盐）及位置（A和/或D环）的差异会影响CEs的酶降解、转化过程。D’Ascenzo等［83］的实验结果表明，A环（E1-3G、17β-E2-3G、E3-3G）CGEs比D环（17β-E2-17G、E3-16G）CGEs易于解离，不过一旦反应启动，一天内均可完全解离为相对应的FEs；而对于CSEs，E1-3S、17β-E2-3S和E3-3S完全解离需6-8 d，说明污水中ArySTS活性相比于GUSB弱得多。Liu等［16］比较了5种CEs的解离速率，并划分为低（E1-3S）、中等（E1-3G、17β-E2-3S和E3-3G）和高（E3-16G）解离速率。Gomes等［84］通过活性污泥批试验表明，CEs（E1-3S、E1-3G和E3-16G）在微生物分泌的酶作用下可解离为FEs，而灭菌条件下未检测到FEs，解离优先顺序为E1-3G＞E3-16G＞E1-3S，其影响因素为：结合基团＞基团位置＞SEs类型。

水解酶通过解离硫酸盐或葡糖苷酸盐结合基团将CEs水解为相对应的FEs，氧化还原酶可催化FEs形成C2、C4位自由基及C3位苯氧自由基中间体，通过C-O-C、C-C共价键自耦合、交叉耦合形成二聚体、三聚体，甚至高聚体。环境中自由及结合态SEs的酶降解、转化路径如图3所示。

4 展望

酶对环境中自由及结合态SEs的去除的应用受到诸多因素限制，对今后酶在SEs降解转化的规模化应用、机理研究、联合应用、固定化酶、酶工程等方面进行了展望。

酶催化去除SEs的研究大多处于小试、中试试验阶段，在污水、污染土壤修复中的应用相对较少［31，43，47，49，52］，由于理论研究与实际应用存在差异，评估酶在实际应用中的可行性十分重要。污水中各种干扰因素会对酶的催化氧化效果产生影响，如pH、温度、盐度、溶解氧、重金属、抑制物质等［36］。应进一步研究酶处理含SEs污水的工作机理和环境因素的影响，将理论应用于实际工业化处理中。酶膜反应器（Enzymatic membrane reactor，EMR）可应用于污水中有机污染物连续处理［14，38，85］，目前已有研究在小试阶段应用EMR处理FEs，去除效率可达到 80%-100%［20，43，60］，常用的膜材料有醋酸纤维素（Cellulose acetate，CA）、硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）、聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene，PTFE）、聚丙烯腈（Polyacrylonitrile，PAN）、聚醚砜（Polyethersulfone，PES）、聚酰胺（Polyamide，PA）等［85］。在规模化应用时，需要解决酶失活以及膜的持续性能问题，同时，EMR在SEs特别是CEs去除方面的应用仍需进一步开发和研究。酶催化应用于SEs污染土壤修复不会产生二次污染，然而不同土壤类型、气候条件、微生物群落等均会对酶修复SEs污染土壤产生影响，实现场地修复仍需要长期系统地研究。

在酶处理SEs过程中伴随着中间产物的产生，且有些产物仍具有雌情活性，而大多数研究没有检测反应后总雌情活性，以及对降解、转化产物进行鉴定。随着高分辨质谱（HRMS）、核磁共振（NMR）等分析检测技术的发展［58，86］，应在反应中间产物的鉴定，自由基的生成，C-O-C、C-C键聚合产物优先顺序及比例等方面展开研究，进一步阐明SEs的酶催化反应机理，比较不同类型的酶对SEs的去除效率，深入分析SEs的降解、转化产物及路径。

WRF（如Trametes versicolor、Phanerochaete chrysosporium）可分泌Lac、LiP、MnP，且不同种类的菌分泌的酶类型存在差异，利用WRF分泌的胞外酶体系催化氧化FEs，可作为规模化应用发展的方向［51，59］。通常污水、污泥、土壤中存在着多种类型的自由态和结合态SEs，是十分复杂的混合体系，而单一种类的酶很难同时去除不同形态的SEs。在GUSB-Lac联用酶体系处理污水中不同形态SEs（E1、17β-E2、17β-E2-3G）的试验中，Tanaka等［22］发现几种化合物均能够得到有效去除。水解酶与氧化还原酶联用同时处理复杂基质中的FEs和CEs（CSEs和CGEs），或产生这些酶的微生物的联合使用（如WRF和E. coli）可作为今后研究的重要课题。

溶解态的游离酶在污水中存在易变性失活、易流失、难以回收等问题，从而导致处理成本过高，限制了其大规模应用。酶固定化技术可以提高酶的稳定性，实现重复利用，并在SEs的去除中得以应用［54，87-89］，主要分为物理法（如吸附）和化学法（如包埋、微胶囊、交联、共价结合），且各有优缺点，载体材料及固定化技术的选择取决于酶的类型和催化过程［54，90］。探寻经济、高效、生物相容且环境友好的固定化材料，降低酶活性损失并提高稳定性是未来发展的方向。

自然条件下微生物产生酶的量非常少，提高酶产量和催化效率，降低应用成本等是需要解决的主要难题，可通过酶工程（如纳米酶、修饰酶和超酶）、基因编辑、DNA重组等技术提高酶产量、稳定性及活性、催化效率及降低酶的别构调节［51-52，91］。