Surepath非妇科液基制片的经验分享*

刘念，李启源，常樱瑜，查俊梅， 苏学英

20世纪50年代细胞学检查方法开始应用于宫颈癌筛查，大幅度降低了宫颈癌的发病率和死亡率。随着液基细胞制片技术、高危型人类乳头状瘤病毒检测，以及p16INK4a/Ki67免疫细胞化学双染等检查方法的应用，宫颈癌筛查质量不断提高[1]。近年来液基制片技术逐渐应用于各种非妇科细胞学样本制备，然而液基制片技术及非妇科细胞学样本种类繁多，不同液基制片技术和细胞学样本的制作方法各异，且均有较多的人工操作步骤，导致制片效果的不稳定，从而限制了液基制片技术在非妇科细胞学领域的应用。我科于2009年引进BDSurepath薄层液基制片技术(LCT制片)并用于非妇科细胞学样本制作，通过不断的摸索与改进，目前对于各种非妇科细胞学样本均能制出较为满意的液基细胞薄片。本文旨在分享我们的具体制片方法和经验，希望能促进液基制片技术在非妇科细胞学领域的应用，提高非妇科细胞学的诊断水平。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

主要仪器：AutoCytePREP全自动液基制片机等；主要试剂：红色保存液(CyteRichRed)、苏木素染液、EA/OG染液、TBS缓冲液(ph7.5～8.5)、消化液(化学名：巯基乙酸铵水溶液CAS5421-46-5)等。

1.2 操作步骤

1.2.1上机前处理

1.2.1.1取材与固定 (1)对于样本量45mL及以上的液体类样本，取45mL加入50mL离心管中，经过一次离心倾出上清液，取细胞沉淀加入30mL红色保存液中进行固定；(2)对于少于10mL的液体样本以及痰、穿刺物等非液体类样本，可直接加入30mL红色保存液中，充分摇匀后室温下静置30min进行固定。

1.2.1.2离心 (1)静置过的样本，放入离心机以600g的转速离心10min，倒掉上清液，加入10mLTBS缓冲液，充分摇匀并转移至12mL离心管内；(2)转移后的样本，放入离心机以600g的转速再次离心5min，倒掉上清液并充分振荡。

1.2.2上机染色 将经过预处理的非妇科细胞学样本，置于AutoCytePREP全自动液基制片机上，启动PrepStain非妇科染色系统，并按照程序设置相应的参数，进行全自动染色。

1.2.3透明和封片 (1)透明：上机染色完成后，取下载玻片置于盛有环保液(或二甲苯替代液)的染缸内透明。分别过3次环保液透明剂(第1次2min，第2、3次各1min)进行透明；(2)中性树胶封片。

2 结 果

细胞均匀分布在载玻片中央直径13mm的圆形区内，细胞团具有三维立体感，且保留了细胞原有的排列方式。相对于传统涂片，细胞更集中、形态更清晰，可清楚地观察到细胞质和细胞核的细微结构；薄片背景更干净且保留了诊断所需的线索，如肿瘤素质，炎性坏死等，利于非妇科细胞学的诊断(图1、2)。

图1 痰液中的腺癌细胞 (箭头所示)，巴氏染色×400。

Figure 1. Adenocarcinoma Cells in Sputum (as indicated by the arrows);Papanicolaou Staining×400

a.Onlyasmallnumberofdegeneratedatypicalcellswerefoundonthetraditionalsmears.b.Manywell-formedtumorcellswerepresentedontheliquid-basedpreparationslide.

图2 液基薄片中的肿瘤细胞保留了原有的排列方式

Figure2.TumorCellsontheLiquid-basedPreparationSlidesRetainedTheirOriginalArrangement

a. Adenoid cystic carcinoma; basal cell-like tumor cells arranged in strips or attached to the surface of characteristic mucous ball were found on the liquid-based preparation slide of bronchial brushing;papanicolaou staining×400. b. Small cell carcinoma; tumor cells with finely granular chromatin could be seen squeezing each other on the liquid-based preparation slide;papanicolaou staining×400.

3 讨 论

非妇科液基学制片与传统涂片比较具有背景更干净、细胞更集中、分布更均匀、形态更清晰等优势，并可用于特殊染色和免疫细胞化学等辅助检测，有利于提高非妇科细胞病理的诊断水平[2-6]。但也有文献报道非妇科液基制片会出现细胞量减少，细胞退变或皱缩，肿瘤背景消失，成团的细胞失去原有的排列方式等不利于病理医师观察的现象[3，7-9]，有时还会出现薄片上细胞重叠，染色不佳或交叉污染等。根据我们多年的实践和体会，如果选择了合适的液基细胞制片技术，严格按照操作流程制片并在制片过程中注意了以下细节，均可以制备出满意的薄片。

我们采用LCT离心沉降式制片技术进行制片。首先要重视各类样本的取材和预处理：1)大于50mL的液体样本在收到样本后，需要静置10min让细胞沉淀，取材时倒掉上清液，尽量吸取容器底部的沉淀物，这样有助于增加收集的细胞量。这一步非常重要，如果被忽略，则会导致细胞量减少； 2)第一次离心后，若沉淀物较多(如果50mL样本的离心沉淀物超过5mL为量多)，仅需吸取少量(约1～2mL)的样本装入红色保存液中；上机染色前应在小离心管内加入适量TBS缓冲液进行稀释，并在沉降管内加入3～5滴TBS缓冲液作为铺垫，以减少细胞堆积重叠，并能防止上机染色时过多的细胞脱落造成交叉污染；另外，样本每次离心后应充分摇匀或振荡，使离心管底部的沉淀物完全散开，使细胞能够充分接触红色保存液和TBS缓冲液。离心后若有食物残渣等杂质以及体积较大的块状物可用纱布过滤； 3)对于血性成分较多的样本，需在取材后滴加数滴冰醋酸摇匀(一般加3～5滴)，室温下静置10min后再离心。离心后可见样本出现分层，上层为上清液，下层为血凝块，用吸管取二者之间的灰白区样本少许(约1～2mL)，加入红色保存液中，再进行后续操作。冰醋酸有破坏红细胞的作用，经过处理后薄片上红细胞明显减少(图3)。但冰醋酸会加深苏木素的染色，因此不可过多滴加，以免影响染色效果； 4)痰液样本在取材时尽量选取有血丝或灰白色颗粒部分。取材后除了加入红色保存液外，还需滴加数滴消化液(约3～10滴)，并充分震荡促使粘液溶解。如果粘液未能充分溶解，则可能导致细胞量减少。

图3 血性胸水液基薄片

Figure 3.Liquid-based Preparation Slides of Bloody Pleural Fluid

a.Theslidewasbloodyifitwasnottreatedwithglacialaceticacid;papanicolaoustaining×100;b.Afterglacialaceticacidwasused,onlyafewredbloodcellswerefoundontheliquid-basedpreparationslide;thebackgroundwascleanerthanbefore;papanicolaoustaining×400.

其次要重视透明和封片：1)染色后需过3次环保液或二甲苯进行透明。每次制片前都需检查环保液或二甲苯是否带水，即需观察试剂底部是否有水珠，若有水珠应及时更换，以免影响脱水效果，以致镜下观呈水雾状，细胞模糊不清，且容易掉色(图4a)； 2)另一方面，红色保存液虽能起到一定的固定作用，但并不能完全固定细胞的形态。一旦玻片暴露在空气中则会发生干片，细胞会立即退变，镜下观细胞皱缩、细胞核深染，染色质结构不清晰(图4b)，不利于观察。所以制片完毕后,应将玻片迅速放置在100%乙醇或者透明剂内,整个制片过程包括封片均要确保湿片,可避免此现象发生。

若诊断需要，还可利用液基样本进行特殊染色或免疫细胞化学检测[10-11]。如果进行特殊染色，需先制作液基白片，然后将白片置于95%乙醇内固定30min，再经梯度酒精至水，接着按常规步骤进行特殊染色。在液基片上进行过碘酸希夫氏 (periodic acid Schiff，PAS)、阿新蓝(Ashin blue，AB)、黏液卡红、六氨银和抗酸染色等均达到良好的效果，有助于病原体的识别，显示与确定细胞内外的正常结构或病理过程中出现的异常物质(图5)。如需进行免疫细胞化学检测，也要先制作液基白片，然后将白片置于4%多聚甲醛内固定30min，再用蒸馏水清洗3次去除残留的多聚甲醛，然后按常规免疫细胞化学的步骤进行检测。结果显示液基薄片上各种抗体阳性信号定位准确，背景干净，有助于分析细胞类型和来源(图6)。

图4 腹水液基薄片

Figure 4.Liquid-based Preparation Slides of Peritoneal Fluid

a.Theslidewasfoggywithwater;papanicolaoustaining×200.b.Thecellswereobviouslyshringkingonthedriedslide,andthefinestructureofcellscouldnotbeclearlyobserved;papanicolaoustaining×200.

图5 肺泡灌洗液液基薄片中的毛霉菌(箭头所示)，PAS×400

Figure 5. Mucor on the Liquid-based Preparation Slide of Alveolar Lavage Fluid (as indicated by the arrow); PAS×400.

图6 胸水液基薄片中转移性肺腺癌细胞呈TTF-1核阳性，Envision×400

Figure 6. Metastatic Lung Adenocarcinoma Cells on the Liquid-based Preparation Slide were Positive for TTF-1 and the Positive Signals were Localized in the Nuclei; Envision×400.

高质量的制片是病理诊断的基础和保障，本文目的是通过分享四川大学华西医院病理科多年来积累的非妇科液基制片经验，以促进该技术的应用，提升非妇科细胞学的诊断水平，让更多的患者受益。

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