木兰花碱减轻慢性应激小鼠抑郁样行为及对脑部LSD1组蛋白修饰的影响

曹冰雁，刘艺洁，武莉莉，费乔曼，杨冰，张玲，乔卫△

酸枣仁（Zizyphi Spinosae Semen，ZSS），又称作枣仁、酸枣核，为鼠李科植物酸枣的干燥种子，多用于治疗惊悸多梦、盗汗、虚烦不眠等症。木兰花碱，又名木兰碱，在酸枣仁中含量较高［1］，但关于其抗抑郁作用的报道较少［2］。表观遗传是指在不改变核苷酸序列的前提下，通过对染色体等的可逆性修饰来改变基因的表达。可逆性修饰包括DNA修饰、RNA沉默以及组蛋白修饰等方面［3］。其中组蛋白修饰常在相关酶的催化作用下，进行甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰［3］。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）是第一个被发现的组蛋白特异性去甲基化的酶。LSD1 与神经细胞增殖、情绪表现、学习记忆等有关［4］。本研究采用慢性不可预见性温和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）进行实验造模，观察木兰花碱对抑郁小鼠行为学的影响，并在基因与蛋白水平检测LSD1含量的变化。

1 材料与方法

1.1 一般材料 （1）实验动物。健康雄性ICR小鼠，SPF级，体质量18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（津）2005-0001。动物饲养温度为24～28 ℃，自然昼夜节律光照，适应7 d 后进行实验。（2）仪器。Centrifuge 5810R 离心机（德国Eppendorf 公司）；TBE-1000A高速逆流色谱仪（上海同田技术有限公司）；Nano Drop®2000c（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；双反应模块梯度PCR仪（美国Bio-rad 公司）；7500 Real-time PCR System（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白电泳槽（美国Bio-rad 公司）；多功能成像分析系统（英国UVItec分子生物成像系统）。（3）药品及试剂。酸枣仁购自安徽亳州市药都国草堂药材店，经天津医科大学药学院周晔教授鉴定为酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou 干燥成熟的种子。本实验室经提取分离得到酸枣仁中木兰花碱（＞95%）；石油醚、乙醇、正丁醇、盐酸、氢氧化钠均为分析纯（天津基准化学试剂有限公司）；TRIzol®（美国Invitrogen 公司）；SYBR Green Master Mix 实时定量PCR 试剂盒（瑞士Roche 公司）；Revert AidTMReverse Transcription Kit 反转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；兔源LSD1 单克隆抗体（英国Abcam 公司）；鼠源β-肌动蛋白单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；ECL化学发光液（美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 健康雄性ICR小鼠共40只，按照体质量编号，采用抽签法将小鼠随机分为4 组，即正常对照组（control 组）、抑郁模型组（PG 组）、木兰花碱高剂量组（MH组）和木兰花碱低剂量组（ML组），每组10只。根据小鼠体质量进行灌胃给药，MH 组给予药17.3 mg/（kg·d），ML 组给予药7 mg/（kg·d），control 组、PG 组给予等量蒸馏水。于每日8:00—9:00灌胃1次。采用21 d慢性不可预见性温和刺激构建小鼠抑郁模型，除control 组外，其余组小鼠在21 d 内随机安排10 种应激因素，每天给予任意2 种刺激，为避免小鼠产生适应性，平均每种刺激给予4次。刺激方式包括潮湿饲养12 h、无垫料饲养12 h、冷水游泳（25 ℃）6 min、倾斜12 h、昼夜颠倒、夹尾1 min、热水游泳（45 ℃）6 min、睡眠剥夺12 h、禁食12 h、禁水12 h［5］。

1.2.2 悬尾实验（tail suspension test，TST） 将小鼠尾尖端1/3处固定在悬尾箱内，使动物呈悬空倒挂状，悬挂两侧用隔板挡住小鼠视线。动物为克服不正常体位而挣扎活动，但当感觉无望后，停止挣扎。实验共进行6 min，记录后4 min 内的不动时间。

1.2.3 强迫游泳实验（forced swimming test，FST） 将小鼠单独放在盛有温水的深10 cm、直径18 cm透明玻璃缸中，水温25 ℃。小鼠入水后会挣扎试图逃跑但又无法逃脱，感觉无望后，仅将头露出水面四肢呈不动状态，实验进行6 min，记录后4 min内小鼠的不动时间。

1.2.4 小鼠脑组织总RNA 的提取以及逆转录 取小鼠脑组织，加入TRIzol®试剂，按照说明书提取总RNA。用Nano Drop®2000c 测定RNA 浓度。加入相应的引物，使用Revert AidTMReverse Transcription Kit反转录试剂盒进行逆转录。

1.2.5 实时荧光定量PCR 按照SYBR Green Master Mix说明书进行操作，PCR反应体系为：SYBR Green Master Mix 10µL、上下游引物（10µmol/L）各0.2µL、cDNA 1µL、H2O 8.6µL。PCR引物序列如下：β-actin上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′；LSD1上游5′-CGACTTCCCCATGACCGAAT-3′ ， 下 游 5′- GAGTGGCTTCAAACGTCAGC-3′。反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃40 s，40个循环。采用2-ΔΔCt方法处理数据。

1.2.6 Western blot 法检测LSD1 的表达情况 将脑组织研碎，加入含蛋白酶抑制剂（Phenyl methane sulfonyl Fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液提取总蛋白，之后测定蛋白浓度。根据各组所测蛋白浓度，加入4×SDS 上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存。将蛋白用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，采用湿转的方法将蛋白转移至PVDF 膜上，使用5%的脱脂奶粉进行封闭，分别加入兔源LSD1（1∶5 000）、鼠源β-肌动蛋白单克隆抗体（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，漂洗3次，每次10 min。加入相应的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，ECL化学发光液显色。用image J软件进行灰度分析。

1.2.7 免疫组化法检测LSD1 的表达情况 断头取脑组织，浸泡于10%福尔马林溶液中固定，常规脱水、浸蜡，制成石蜡切片。切片脱蜡、水化后，抗原修复4 次，每次6 min；放置室温后，3%H2O2去离子水室温避光封闭10 min；山羊血清封闭15 min；滴加LSD1 抗体（1∶200），4 ℃过夜。滴加反应增强液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 聚合物，室温20 min；DAB 显色，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化10 min；梯度脱水，中性树胶封片，镜下观察，拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件对以上数据进行处理，计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木兰花碱对抑郁小鼠不动时间的影响 与control 组相比较，PG 组小鼠的TST、FST 累计不动时间均延长（P＜0.05）。与PG组相比较，MH组、ML组小鼠的累计不动时间均缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木兰花碱对小鼠不动时间的影响 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木兰花碱对小鼠不动时间的影响 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与control组比较，b与PG组比较，P＜0.05

组别control组PG组MH组ML组F TST累计不动时间（s）54.59±22.97 92.10±19.59a 60.71±14.75b 70.60±17.05b 7.574＊＊FST累计不动时间（s）79.10±45.02 123.20±34.05a 59.50±25.44b 75.70±46.71b 4.985＊＊

2.2 木兰花碱对脑部LSD1 表达的影响 在mRNA水平，与control组相比，PG组LSD1表达差异无统计学意义，ML 组LSD1 表达明显升高（P＜0.05）；与PG组相比，ML组LSD1表达明显升高（P＜0.05）。在蛋白水平，与control组相比，PG组LSD1表达明显降低（P＜0.05），ML 组LSD1 表达明显升高（P＜0.05）；与PG 组相比，ML 组LSD1 明显升高（P＜0.05），见表2、图1。

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木兰花碱对小鼠脑部LSD1表达的影响（n=3，±s）

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木兰花碱对小鼠脑部LSD1表达的影响（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与control组比较，b与PG组比较，P＜0.05

组别control组PG组ML组F mRNA表达1.00±0.03 0.84±0.26 1.36±0.10ab 7.971＊蛋白表达0.47±0.02 0.37±0.01a 0.71±0.02ab 302.332＊＊

Fig.1 Effect of magnoflorine on the expression of LSD1 in brain of mice图1 木兰花碱对小鼠脑部LSD1蛋白表达的影响

2.3 小鼠脑部LSD1 免疫组化染色结果 PG 组LSD1 呈低表达，control 组、ML 组LSD1 蛋白表达阳性细胞数明显增多，见图2。

Fig.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1（immunohistochemistry staining,×400）图2 木兰花碱对LSD1表达的影响（免疫组化染色，×400）

3 讨论

本研究采用CUMS 法建立小鼠抑郁模型，引起小鼠行为学、神经免疫以及内分泌等方面的改变，模拟出人类抑郁症的形成，与人类抑郁症症状相似［6］。酸枣仁具有镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑等多种药理活性［7-8］。已有研究证实，酸枣仁总生物碱具有显著的抗抑郁作用，可降低脑部单胺氧化酶的含量［9］，其中异喹啉型成分木兰花碱的含量最高。据报道，异喹啉类生物碱在抗抑郁治疗上有较好的应用前景［10］。现有药理研究表明，木兰花碱具有抗氧化、抗心律失常、降压等药理作用［11-12］，但在抗抑郁方面报道较少，因此本研究以木兰花碱作为研究对象，评价其潜在的抗抑郁作用。

抑郁小鼠行为学实验结果显示，木兰花碱能显著改善CUMS小鼠的抑郁行为，而木兰花碱高、低剂量组对于改善小鼠抑郁样行为未见明显差异。因此，本研究选择木兰花碱低剂量组进行后续的分子生物学实验。本实验室前期研究确认，酸枣仁发挥抗抑郁作用最佳组分配伍配比为黄酮与生物碱部位1∶12～1∶14［13］。本实验中以药典规定的酸枣仁每日用量12 g为依据，先折算成小鼠剂量后，根据2种最佳组分中木兰花碱的含量计算出给药高低剂量。本实验中木兰花碱服用剂量低于药代动力学文献报道的剂量［14］，对正常小鼠未见明显不良反应。

表观遗传学的修饰与调控研究逐渐成为生命科学的热点，研究大多围绕着肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病以及神经疾病开展。组蛋白修饰是表观遗传学研究中的一项重要内容，主要包括乙酰化与甲基化研究。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对于神经疾病的治疗具有较大的潜力［15］。目前组蛋白去甲基化酶研究大多围绕着肿瘤［16］、心肌梗死［17］、炎症［18］等进行，而对神经疾病治疗的报道较少。由于组蛋白去甲基化酶LSD1 与单胺氧化酶具有紧密的同源关系，为单胺氧化酶家族的成员［19］，而单胺氧化酶抑制剂是目前临床常用的抗抑郁类药物，已有研究探索以LSD1 抑制剂治疗抑郁症［20-21］。本研究结果显示，抑郁小鼠脑部的LSD1 含量降低，经木兰花碱治疗后，在基因和蛋白水平上LSD1 的表达均升高，这与研究报道相反［20-21］。因此，在治疗抑郁症方面，主要是通过升高还是降低LSD1 表达仍未明确，需进一步深入研究。

综上所述，慢性应激造模后，抑郁小鼠在TST及FST 行为学上不动时间延长，且LSD1 基因、蛋白的表达水平均下降。通过木兰花碱治疗后减轻了其抑郁样行为，同时也提高了LSD1 的表达。说明木兰花碱具有一定的抗抑郁效果，并且木兰花碱可能是通过LSD1靶点发挥其抗抑郁治疗作用。